細胞内アゴニストによるクラスB1 GPCR活性化 | 南寧マイクロインターラットレ株式会社

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G タンパク質共役受容体 (GPCR) は通常、オルソステリック結合ポケットに特定のリガンドを収容します。リガンドの結合は受容体のアロステリックな構造変化を引き起こし、細胞内トランスデューサー、G タンパク質、β-アレスチンの活性化につながります。これらの信号は悪影響を引き起こすことが多いため、各トランスデューサーの選択的活性化メカニズムを解明する必要があります。したがって、多くのオルソステリックバイアスアゴニストが開発されており、最近では細胞内バイアスアゴニストが幅広い関心を集めている。これらのアゴニストは受容体の細胞内腔内で結合し、細胞外側から受容体のアロステリック再構成を起こすことなく、他のシグナル伝達経路よりも特定のシグナル伝達経路を優先的に調整します1、2、3。しかし、現在利用できるのはアンタゴニスト結合構造のみであり 1,4,5,6 、偏ったアゴニスト結合が細胞内腔内で起こることを裏付ける証拠はありません。これにより、細胞内に偏ったアゴニズムと潜在的な薬剤開発の理解が制限されます。今回我々は、PTH1RアゴニストであるPCO371に結合したGとヒト副甲状腺ホルモン1型受容体（PTH1R）の複合体の極低温電子顕微鏡構造を報告する。 PCO371 は PTH1R の細胞内ポケット内に結合し、G と直接相互作用します。 PCO371 結合モードは、細胞外で誘導されるアロステリックシグナル伝播を伴わずに、細胞内領域を活性構造に向けて再配置します。 PCO371 は、膜貫通ヘリックス 6 の大きく外側に曲がった構造を安定化し、β-アレスチンではなく G タンパク質への結合を促進します。さらに、PCO371 は高度に保存された細胞内ポケット内に結合し、15 個のクラス B1 GPCR のうち 7 個を活性化します。私たちの研究は、新しく保存された細胞内アゴニスト結合ポケットを特定し、受容体とトランスデューサーの境界面を標的とする偏ったシグナル伝達機構の証拠を提供します。

GPCR はヒトタンパク質の最大のファミリーを構成し、ほぼすべての生理学的プロセスに関与しています。その結果、市販薬の 30% 以上がそれらを標的としています7。アゴニストは GPCR の細胞外オルソステリック結合ポケットに結合し、構造変化を誘導し、膜貫通ドメイン (TMD) の活性構造を安定化します。オルソステリックポケットは非常に多様な形状と配列を発達させており、これによりさまざまな細胞外刺激への応答が可能になります8。オルソステリックアゴニストに加えて、多数のアロステリックモジュレーターが生成されており、以前の構造研究によりさまざまなアロステリックポケットが特定されています9。オルソステリック部位と比較して、アロステリック部位はより多様なアミノ酸残基を持つ傾向があります。したがって、アロステリックリガンドは受容体に対するサブタイプ特異性を提供します。これまでの構造研究により、個々の受容体によるオルソステリックおよびアロステリックリガンドの正確かつ特異的な認識様式が明らかになりましたが、異なる受容体サブタイプにわたる保存されたアゴニスト結合ポケットはまだ発見されていません 10。

ほとんどのアゴニストは複数のシグナル伝達経路を活性化し、これらのシグナルの一部は時として有害な薬理効果を誘発します。特定の細胞内トランスデューサーを優先的に活性化する偏ったアゴニストは、副作用を軽減しながら治療効果を最大化する可能性があります10。現在の偏ったアゴニストは一般にTMDの細胞外半分に結合しますが、細胞内側、特に受容体とトランスデューサーの界面に結合するアゴニストは、偏ったシグナル伝達作用を正確に調節するために好ましい可能性があります2。これまでに、細胞内リガンド結合 GPCR の 6 つの構造が報告されています 1、4、5、6、11、12。しかし、これらのほとんどはアンタゴニストが結合した構造であり、細胞内トランスデューサーポケットに結合する偏ったアゴニストの構造的証拠はありません 1,4,5,6。この知識の欠如により、この細胞内に偏ったアゴニズムを理解し、微調整する能力が制限されます。

PTH1R はクラス B1 GPCR であり、ミネラルイオンの恒常性と骨代謝の主要な調節因子です。 PTH1R は、副甲状腺ホルモン (PTH) および副甲状腺ホルモン関連ペプチド (PTHrP) リガンドに応答し、Gs、Gq、および β-アレスチンを活性化します 13。これらのリガンドの天然型および修飾型は、実質的な同化骨形成を誘導し、骨粗鬆症の臨床治療に使用されます14、15。しかし、これらのリガンドは異化性骨吸収も誘発し、悪影響を引き起こします。治療効果と副作用のバランスは、Gs を介したサイクリック AMP 産生の持続時間の違いに依存します 16。細胞膜でのパルス Gs 活性化は、一過性の cAMP 産生を誘導します。逆に、活性化された PTH1R は β-アレスチンによって取り込まれ、初期エンドソームでの持続的な cAMP 産生を誘導し、副作用を引き起こします。したがって、G タンパク質に偏ったアゴニストは骨粗鬆症の治療に有用です。しかし、PTH1R における G タンパク質に偏った活性化のメカニズムはほとんどわかっていません。

我々は以前に PTH および PTHrP-PTH1R-Gs 複合体の構造を報告し、悪影響が生じる理由についての構造的洞察を提供しました 17。この情報はPTH1Rを標的とするペプチドベースの医薬品開発にとって重要であるが、ペプチドは皮下注射で投与する必要があり、患者の身体的負担を軽減するには非ペプチド性の経口投与アゴニストが望ましい。最近、非ペプチド化学 PTH1R アゴニストである PCO371 が、経口投与により in vivo で PTH 模倣活性を示すことが示されました 18。ただし、PCO371 結合 PTH1R の構造情報はありません。したがって、PCO371 の結合部位と活性化機構はまだ解明されていません。

PCO371 がどのように PTH1R に結合し、その構造再構成を誘導するかを解明するために、PCO371-PTH1R-Gs シグナル伝達複合体の構造を決定しました。 PTH1R を HEK293 細胞で発現させ、コレステリルヘミスクシネート (CHS) を含むラウリルマルトースネオペンチルグリコール (LMNG) の溶液に可溶化し、PCO371 の存在下で CHS 溶液を含むグリコジオスゲニン (GDN) 中で精製しました。高濃度での PCO371 の溶解度要件のため、精製中に pH 9.0 の溶液を使用しました (方法)。 PCO371 は、弱塩基性条件 (pH 9.0) で Gs 活性を有意に増加させましたが、PTH 誘導性の Gs 活性化は生理的 pH (pH 7.4) と pH 9.0 の両方で同等でした (拡張データ図 1)。 PCO371 に結合した PTH1R を、操作された mini-Gs ヘテロ三量体およびナノボディ 35 (Nb35) と混合して、Nb35 で安定化された PCO371 – PTH1R – mini-Gs 複合体を形成しました。精製後、このシグナル伝達複合体を、K3 検出器を備えた Titan Krios G4 極低温透過型電子顕微鏡を使用して画像化しました。粒子画像は 2D および 3D 分類によって分類され、次にそれを使用して 2.9 Å のグローバル解像度で極低温電子顕微鏡 (cryo-EM) 密度マップが作成されました (図 1a、拡張データ図 2 および拡張データ表 1)。この一次マップにより、PTH1Rの細胞外ドメインを除く、PCO371-PTH1R-Gs複合体の二次構造と側鎖の配向を明確に割り当てることができました（図1bおよび拡張データ図3）。細胞外ドメインに対応する明確な密度は観察されず、これは、以前に決定された PTH-PTH1R-Gs 複合体構造や、低分子アゴニスト結合グルカゴン様ペプチド 1 受容体 (GLP-1R)-Gs 複合体のいくつかの構造とは対照的でした (拡張データ図 4a、b)。この構造の違いは、細胞外ドメインが非常に柔軟であり、Gs と PTH1R の結合を可能にするために特定の立体構造状態を必要としないことを示しています。

a、PCO371 – PTH1R – Gs 複合体の直交図。クライオ EM ポテンシャルマップから構築され、サブユニットに従って色分けされています。バイオレット、PCO371 結合 PTH1R。マゼンタ、PCO371; 黄色のミニ Gαs Ras 様ドメイン。トマト、Gβ1; ネイビー、Gγ2。パウダーブルー、Nb35。 b、PCO371結合ポケット付近のPCO371の密度マップおよび構築モデル。 c、PCO371結合部位の拡大図。数字の上付き文字は、受容体 TMD 領域の Wootten クラス B1 GPCR 番号付けに従った受容体内の相対位置を示します 33。マップは 2.085 e A–3 カウンターレベルで表示されます。 d、PCO371 の化学構造。 PCO371 は 4 つの化学基 (左から右に示す) で構成されています: トリフルオロメトキシフェニル、スピロイミダゾロン、ジメチルフェニル、DMH。

注目すべきことに、PTH1R複合体にはオルソステリック結合ポケット内の明らかなリガンド密度がまったくなく、その特徴は他のアゴニスト結合クラスB1 GPCR構造のほとんどについてこれまで報告されていなかった19（拡張データ図4b）。代わりに、細胞外オルソステリックポケットから空間的に分離された膜貫通ヘリックス2（TM2）、TM3、TM6、およびTM7によって形成された細胞内トランスデューサー結合ポケット内のPCO371に対応する明確な密度を観察しました（図1a〜cおよび拡張）データ図4b)。リガンドと受容体の接触のほとんどはファンデルワールス相互作用と疎水性相互作用によって媒介され、これは PCO371 の疎水性の性質と一致しています (拡張データ表 2)。注目すべきことに、Tyr4597.57（上付き数字はWoottenクラスB1 GPCRの番号付けを反映しています）は、Val4126.44およびPCO371の主鎖カルボニル基と水素結合を形成し、これによりPCO371-PTH1R-Gs複合体が安定化されます（図1c）。さらに、Tyr4597.57の側鎖はPCO371を膜脂質から隔離しました（図1a、b）。 PCO371上のジメチルヒダントイン（DMH）のカルボニル基はArg2192.46と塩橋を形成しました（図1a、c、d）。注目すべきことに、PCO371のDMH基（図1d）はGαのカルボキシ末端フックと相互作用し、PCO371を受容体コアにしっかりと詰め込みました（図1a、d）。これらの相互作用は、PCO371 DMH グループの欠如が効力の大幅な低下につながることを明らかにした、以前の化学構造活性相関研究の結果と一致しています 20,21。我々の構造観察は、以前の化学構造と活性の関係の所見と合わせて、PCO371 が G および受容体の細胞内腔に結合するアゴニストであることを示唆しています。

PCO371-PTH1R-G 複合体の全体構造を特徴付けるために、この構造を PTH-PTH1R-G および操作された PTH (ePTH) 結合 PTH1R17,22 の構造と比較しました。 PTH 結合 PTH1R 構造は、活性クラス B1 GPCR 構造の顕著な特徴を備えていました。簡単に言うと、この構造の細胞外部分は、TM1、TM7、および 3 番目の細胞外ループの内向きの動きと、TM6 の外向きの動きを示し、これが細胞内部分での TM6 の顕著な外向きの動きを引き起こしました。逆に、唯一の不活性様 PTH1R 構造である ePTH 結合 PTH1R 構造は、TMD コアと細胞内部分で不活性な立体構造を示しましたが、細胞外部分は操作されたアゴニストの結合により活性な立体構造に向かってわずかにシフトしていました（図 2）。 2a、b)。

a、TM2〜TM5上に整列したPCO371-PTH1R-GおよびPTH-PTH1R-G（クラス2、代表的な活性型）複合体の重ね合わせ。 b と c の目と矢印の記号は画角を示します。 b、c、PCO371結合活性PTH1R、PTH結合活性PTH1R、およびePTH結合不活性PTH1Rの重ね合わせたTMDの細胞外(b)および細胞内(c)の図。 b、両方向矢印は、PCO371 結合 PTH1R と PTH 結合活性型 PTH1R の構造間、またはそれらの間の Thr1921.44 (TM1)、Ile4226.54 (TM6)、および Met4457.43 (TM7) 残基の Cα 原子の距離を示します。 PCO371結合およびePTH結合の不活性様PTH1Rの構造。 c. 一方向矢印は、PCO371 結合 PTH1R および PTH 結合 PTH1R における TM6 の典型的な外向きの動きを示します。 d、PCO371とPTHのアロステリック競合結合機構。 PTH と PCO371 は、破線の円で他のリガンド結合立体構造と衝突します。 e、PTH結合PTH1R、PCO371結合PTH1R、不活性または不活性様クラスB1 GPCR（PTH1R、GCGR、GLP-1RおよびCRF1R）、および内因性アゴニスト結合クラスB1 GPCR（PTH2R、PTH2R、 SCTR、GHRHR、PAC1R、VIP1R、VIP2R、GCGR、GIPR、GLP-1R、GLP-2R、CALCR、CALRL、CRF1R、および CRF2R）。 TM6 の Ile/Met/Val6.54、Gly6.50、および Val/Ala/Leu6.39 残基の Cα 原子間の角度を示します。 PCO371 に結合した PTH1R の角度は、Pro6.47 のキンクにより Leu6.39、Pro6.47、および Ile6.54 の間で計算されることに注意してください。

PCO371-PTH1R-G、PTH-PTH1R-G、および ePTH 結合 PTH1R の構造間の比較により、PCO371 によって誘導される活性状態の明確な立体構造が明らかになりました。まず、PCO371結合PTH1RのTM1、TM6、およびTM7の細胞外部分は、PTH結合活性型PTH1R構造と比較して、それぞれ約6Å外側、6Å内側、および4Å外側にシフトした（図2a、b）。 ePTH結合PTH1Rと比較して、TM1およびTM7のこれらの部分はさらに外側に移動し、TM6の部分はさらに内側に移動した。これらの動きは、以前に特徴付けられたクラスB1 GPCR構造の不活性-活性構造変化19、22、23、24、25（図2bおよび拡張図5a）と一致しており、TMDの細胞外部分が不活性構造をとることを示しています。 PCO371 結合 PTH1R 構造内。細胞外部分とは対照的に、PCO371に結合したPTH1RのTMDの細胞内部分は、活性型PTH-PTH1R-Gs構造の動きと同様のTM6の外側への動きを示しました（図2c）。この明確な細胞外構造により、TM6 は巻き戻され、PCO371 結合 PTH1R 構造内で適度にねじれた状態 (約 145°) になりました。これは、PTH 結合 PTH1R 構造内の鋭くねじれた TM6 (約 90°) とは異なります (拡張データ図 1)。 5b)。 PCO371結合PTH1RとPTH結合PTH1R構造を重ね合わせると、PCO371がPTH結合PTH1Rの鋭くねじれたTM6立体構造と空間的に衝突することが明らかになりました（図2d）。さらに、PCO371 結合 PTH1R の中程度にねじれた TM6 立体構造は、PTH 結合 PTH1R 構造内の PTH のアミノ末端と空間的に衝突し（図 2d）、以前のリガンド競合実験と一致しました 18。活性クラスB1 GPCR構造を重ね合わせると、内因性または化学アゴニストに結合した活性クラスB1 GPCR構造におけるTM6のキンク角（約90°〜100°）がほぼ同一であることが明らかになりました（図2e、左、および拡張データ図5c、上）そして真ん中）。したがって、PCO371 結合によって引き起こされる TM6 の中程度のねじれ (約 145°) は他の活性構造とは異なり、その角度は活性型 (92°) と不活性型 PTH1R 構造 (164°) の角度の中間にあります (図.2e、中央と右、および拡張データ図5c、下）。これらの結果は、PCO371が細胞内トランスデューサーポケットに直接結合し、分子くさびとして機能することを示しています（拡張データ図5d）。この結合位置は、細胞外側からのシグナル伝播を伴わずにTM6の細胞内部分の重要な外側への移動を安定化し、これまでに解析されたクラスB1アゴニストおよびGPCRペアとは異なります。

PCO371 誘発 PTH1R 活性化のメカニズムについての洞察を得るために、クラス B1 GPCR 間の 3 つの重要なモチーフを比較しました。 PxxG (Pro6.47–x–x–Gly6.50) スイッチ。 HETY (His2.50–Glu3.50–Thr6.42–Tyr7.59) 不活性モチーフ 17,26。 PTHはオルソステリックポケットに結合し、アロステリックに再配置を誘導して、PYQ活性モチーフの水素結合ネットワークを再構築します（拡張データ図6a、b、左）。これらの構造変化は、PxxGモチーフのGly4186.50でのTM6の鋭いねじれを促進し、Leu4166.48およびPhe4176.49を再配置しました（拡張データ図6c、d）。 Leu4166.48とPhe4176.49の移動により疎水性クラスターが形成され、TM6の細胞内半分の外側の立体構造が安定化しました（拡張データ図6d）。その結果、再配置されたLeu4166.48はTyr4597.59を押し出し、HETY不活性モチーフを崩壊させ、Gタンパク質を収容するための細胞内腔を開きました（拡張データ図6e）。

PCO371結合PTH1RのTMDは、ePTH結合PTH1R構造と同様の方法で、らせん構造のTM6のPYQ活性モチーフとPxxGスイッチを変形させた（図2eおよび3a〜cおよび拡張データ図6f、g））。 PYQおよびPxxG活性モチーフの不活性立体構造とは対照的に、PCO371のトリフルオロメトキシフェニルおよびスピロイミダゾロン基（図1d）は、ePTH結合PTH1R構造内のVal4126.44-Phe4176.49およびHETY不活性モチーフと激しく衝突しました。、それぞれ（拡張データ図6h、i）。この立体問題を回避するために、我々の構造は、PCO371に結合したPTH1RのTM6がPro4156.47で巻き戻されていることを示し、この残基がPCO371特異的なPTH1Rの活性化に必要であることを示した。これらの構造観察と一致して、PYQ モチーフの変異 (Q4517.49A) と PxxG スイッチの変異 (L4166.48A、F4176.49A および G4186.50L) は、PTH 誘導性の cAMP 蓄積を選択的に減少させましたが、PCO371 活性には影響しませんでした (図 3d および拡張データ図 7)。対照的に、P4156.47L変異は、PCO371活性を選択的かつ完全に消失させたが、PTH活性に対して有意な影響を示さなかった（図3dおよび拡張データ図7）。これらの結果は、Ｐｒｏ４１５６．４７が、ＰＹＱモチーフおよびＰｘｘＧスイッチの立体構造再配置を伴うことなく、ＰＣＯ３７１を介したＰＴＨ１Ｒの活性化に必須であることを示している。

a、PCO371結合PTH1RのTMD領域。 b、c、PYQ アクティブモチーフと PxxG アクティブスイッチの拡大図。 d、PTHまたはPCO371刺激後の野生型（WT）PTH1RおよびPYQモチーフまたはPxxGスイッチ変異体におけるGloSensor cAMP応答。負の対数の最大半値有効濃度（pEC50）および最大応答（Emax）値は、濃度応答曲線から計算されました（拡張データ図7a、c）。 *P < 0.05 および **P < 0.01、二元配置分散分析 (ANOVA) に続いて多重比較分析のダネット検定を使用して計算されました (WT を参照)。 NS、グループ間で有意な差はありません。 e、PCO371 – PTH1R – G、イソプロテレノール – β1 アドレナリン受容体 (β1AR) – G、およびフォルモテロール – β1AR – β-アレスチン複合体を TM2 – TM5 上に並べて重ね合わせたもの。黒い矢印は、Gs 結合構造および β-アレスチン結合構造における TM5 および TM6 の顕著な構造変化を示します (左)。 PCO371 は破線の円 (中央と右) で TM6 と衝突します。 f、PTHまたはPCO371による刺激後のPTH1Rへのβ-アレスチン1およびβ-アレスチン2の動員の濃度応答曲線。 g、PCO371 およびさまざまな濃度の PTH に応答した PTH1R-β-アレスチン 2 の共局在。ビヒクル、100 nM PTH、10 pM PTH、または 100 μM PCO371 で刺激した後の PTH1R と β-アレスチン 2 の共局在の定量化。各刺激条件における個々の細胞の共局在指数は、Fiji (ImageJ) を使用して計算されました。記号とエラーバーは、それぞれ 10 ～ 19 個のセルの平均値と sem を表します。 *P < 0.05 および **P < 0.01、一元配置 ANOVA とそれに続くビヒクル刺激に関する多重比較分析のダネット検定を使用して計算。データは 3 つの独立した実験からのものです (d、f)。

ソースデータ

一般に、TM6 の立体構造は、特定のトランスデューサーの優先的な結合と偏ったシグナル伝達にとって重要です。これまでの研究では、G タンパク質の優先的結合には TM6 の大幅な外側への移動と大きな細胞内腔が必要であるのに対し、β-アレスチンの場合は TM6 のわずかな外側への移動と小さな細胞内腔が必要であることが示されています 27,28,29。 PCO371は、細胞内TM6の著しく外側の立体構造を安定化させる分子くさびとして機能し（図3eおよび拡張データ図5dおよび8a、b）、これは、PCO371がβ-アレスチンよりもGタンパク質を優先的に活性化することを示した。我々の構造的発見と一致して、NanoBiTベースのアッセイは、PCO371結合がβ-アレスチン1およびβ-アレスチン2のリクルートシグナルを無視できる程度しか誘発しないことを明らかにした（図3f）。続いて、PCO371 が G タンパク質に偏ったアゴニストであることを徹底的に実証するために、PTH1R-β-アレスチンの細胞内移行を共焦点顕微鏡で観察しました。我々は、Flagタグに融合したPTH1RとmVenusに融合したβ-アレスチン2をHEK293細胞で発現させた。受容体はAlexa-647融合Flag-M1抗体で標識され、その膜および細胞内局在が共焦点顕微鏡で可視化された。 PTH1Rとβ-アレスチン2の細胞内共局在は、高濃度（100nM）および低濃度（10pM）のPTHで刺激した30分後に発生しました（図3gおよび拡張データ図8c）。対照的に、この細胞内共局在は、cAMPアッセイにおける10 pM PTH刺激に相当する高濃度（100μM）のPCO371による刺激後には観察されませんでした（図3gおよび拡張データ図8c）。総合すると、PCO371 は G タンパク質に偏ったアゴニストであると結論付けられます。我々の研究は、細胞内アゴニストPCO371がGタンパク質を選択的に活性化し、アロステリックシグナル伝達を介さずに直接偏ったシグナル伝達機構を誘導できるという構造的証拠を提供する。

我々の構造は、PCO371がクラスB1 GPCRの高度に保存された残基（Arg2192.46、His2232.50、Leu2262.53、Ile2993.47、Glu3023.50、Leu3063.54、Val4126.44、Leu4136）によって形成される細胞内ポケットと相互作用することを示した。 .45、Met4146.46、Pro4156.47、Leu4166.48、Phe4176.49、Gly4186.50、Phe4547.52、Tyr4597.57およびAsn4638.47）（図4a、b）。このポケットに関係する潜在的な用途を評価するために、cAMP 蓄積アッセイを使用して、すべてのクラス B1 GPCR における PCO371 誘発 cAMP 産生のレベルを測定しました。注目すべきことに、PCO371は15個のクラスB1 GPCRのうち7個を活性化しました（図4cおよび拡張データ図8d）。われわれは系統樹分析30（GPCRdb（https://gpcrdb.org/）を使用して計算）によってGPCR配列の類似性を比較し、PCO371がPTH2Rとグルカゴン受容体を除く、同じグループであるPTH1Rクレードに割り当てられた受容体を活性化することを発見した（ GCGR）（図4d）。

a、PCO371結合PTH1RのTMD領域（上）およびPCO371結合領域の拡大図（中および下）。 b、ヒトクラスB1 GPCRのアミノ酸配列アラインメント。記載されている残基は PCO371 と相互作用します。 c、クラスB1 GPCR間のPCO371誘発GloSensor cAMP応答。レーダーチャートの値は、相対固有活性 (Δlog RIAPCO-peptide) の対数値を示します。これは、内因性ペプチドアゴニストによる刺激後の Emax/EC50 値によって正規化された各受容体の Emax/EC50 値 (RIAPCO) として定義されます。 (RIAペプチド)。線と影付きの領域は、それぞれ 2 回実行された 3 回の独立した実験の平均値と標準誤差を表します。 8 つの PCO371 非感受性 GPCR (PTH2R、GIPR、GLP-2R、GLP-1R、CRF1R、CRF2R、CALCR、および CALRL) では、RIAPCO 値を計算できなかったことに注意してください。したがって、Δlog RIAPCO ペプチド値は -7 未満として示されます。 d、クラスB1 GPCRの系統樹。 PCO371 感受性受容体と PCO371 非感受性受容体は、それぞれ赤線と青線で示されています。 PCO371 は、PTH2R と GCGR を除く PTH1R クレードのメンバーを活性化します。 e、PTHまたはPCO371による刺激後のWTおよびL3706.47P変異体（L370P）PTH2RのGloSensor cAMP応答の濃度応答曲線。記号と誤差バーは、それぞれ、二重に実行された 3 つの独立した実験の平均値と sem を表します。

PCO371 が PTH2R を活性化できなかった理由を決定するために、位置 6.47 の非保存ロイシン残基を調査しました。クラスB1 GPCRは、PTH1RのPCO371認識に重要な役割を果たす6.47位のプロリン残基を広く採用していることを考慮して（図3dおよび拡張データ図6f）、PCO371に対する応答の欠如が異なる原因によって引き起こされるかどうかを調べました。 PTH2R の 6.47 位のアミノ酸。我々の仮説と一致して、L3706.47P PTH2R変異体は、PCO371に応答してcAMP蓄積を生成した（図4eおよび拡張データ図8e）。 PTHは野生型とP4156.47L PTH1Rの両方を活性化したが、PCO371はP4156.47L PTH1Rを活性化しなかったことを考慮すると（図3d）、Pro6.47はPCO371誘導性受容体活性化の必須の決定因子であると結論付けた。

私たちの研究により、PCO371が7つのクラスB1 GPCRに対する多用途のアゴニストであることが明らかになり（図4c、d）、この経口投与可能な第1相薬剤候補がこれらの受容体を標的とする有望な薬剤シードである可能性があることが示唆されています。しかし、PAC1RクレードとGLP-1Rクレード間のPCO371の受容体選択性に関しては疑問が残っています（図4d）。化合物 2 に結合した GLP-1R との構造比較に基づいて、TM6 の細胞外半分と細胞内半分の同時移動が特異的活性化の重要な特徴であると我々は推測しています。化合物 2 は、細胞内 TM6 の外側に結合する細胞内アゴニストです (拡張データ、図 9a、b、左)。化合物 2 に結合した GLP-1R 構造は、オルソステリックペプチドに結合した活性構造 11 と同様に、TM6 に典型的な鋭いねじれを示しました（図 2e および拡張データ図 9b、c）。 GLP-1Rの細胞外構造は、細胞内側の構造変化に連動して再配置されると考えられる。 GLP-1R におけるこの裏返しの構造変化は、クラス A GPCR などの他の GPCR で観察される共通の特徴ですが、細胞外構造変化は PCO371 結合 PTH1R では観察されませんでした。したがって、我々は、PCO371は、典型的に活性化される細胞外構造をとる受容体に結合できないため、受容体活性化にTM6の裏返しの変化を必要としないGPCRのグループのみを活性化すると提案しました（図2d）。この仮説を証明するために、我々は 3 つのキメラ受容体、PTH1R (TM6 を GLP-1R の受容体で置換)、PTH1R (TM6 を PAC1R の受容体で置換)、および GCGR (TM6 を GLP-1R の受容体で置換) を設計し、誘導される cAMP 産生を測定しました。 PCO371による。注目すべきことに、これらの受容体は内因性リガンド応答においてわずかな差異しか示さず、これらのキメラ受容体がその受容体活性を保持していることが示唆された（拡張データ図９ｄ）。さらに、PTH1R（TM6-GLP-1R）はPCO371によるcAMP産生を完全に廃止しましたが、PTH1R（TM6-PAC1R）はPCO371による区別可能なcAMP産生を示しました（拡張データ図9d）。我々の概念と一致して、GCGR (TM6-GLP-1R) も PCO371 による cAMP 産生をほとんど欠いていました (拡張データ図 9d)。これらの結果は、PCO371 が TM6 の細胞外半分から細胞内半分を独立して動員できる受容体を活性化するという我々の提案を強く支持します。

この研究では、PTH1R の新しい細胞内アゴニストポケットと、PCO371 が分子くさびとして機能する非定型的な活性化プロセスを特定しました。以前に報告されたクラスB1 GPCR構造は、オルソステリック部位に結合するペプチドおよび低分子化学アゴニストによるアロステリックシグナル伝達の共通の機構を明らかにしているが、結合様式は化学アゴニストとペプチドアゴニストの間で異なる（拡張データ図4および5）。これらの以前に報告されたリガンドとは対照的に、PCO371はPTH1Rの細胞内トランスデューサーポケットに直接結合し、細胞外側からのアロステリックシグナル伝達を必要とせずにそれを活性化します（図5）。これらの結果は、PCO371が細胞膜をうまく通過し、膜脂質のように細胞内側または膜内領域に直接アクセスしていることを示唆しています（図5）。 Gly4186.50でTM6に典型的な鋭いキンクを誘発する代わりに、PCO371は、その活性に必要なPro4156.47でTM6を巻き戻します（図3eおよび5、および拡張データ図6b、f）。私たちの研究により、GPCR 活性化の明確なメカニズムが明らかになり、創薬戦略の可能性が広がりました。

PTH1R の明確な活性化および機能選択性メカニズム。上、PTH は TM1、TM6、および TM7 の細胞外部分の再配置を誘導し、これにより TM6 の細胞内部分の外側への移動と Gly4186.50 でのキンクの形成が引き起こされます。 PTH に結合した PTH1R は、それぞれ G タンパク質と β-アレスチンに対して優先的な立体構造をとることができます。下の図では、PCO371 は TM6 の細胞内部分を外側に直接移動させ、細胞外再構成を必要とせずに Pro4156.47 で TM6 に適度なねじれを形成させます。 PCO371 に結合した PTH1R は、TM6 の細胞内部分の外側の立体構造を安定化することによって、G タンパク質に対して優先的な立体構造のみを採用します。 ECD、細胞外ドメイン。

細胞内リガンドポケットは、特定のシグナルトランスデューサーと選択的に相互作用して活性化する可能性があるため、GPCR 薬理学においてかなりの関心を集めています。これまでに、複数のアンタゴニスト、ポジティブアロステリックモジュレーター、および対応する GPCR と複合体を形成したアゴアロステリックモジュレーターの構造が報告されています 1、4、5、6、11、12 (拡大図 9a)。これらのリガンドは各 GPCR の細胞内領域と結合しますが、細胞内トランスデューサーポケットにはアゴニストを収容する構造が存在しないため、細胞内側からの偏ったシグナル伝達に関する構造的洞察が制限されます。私たちの構造は、細胞内腔に結合し、G タンパク質と直接相互作用するアゴニストの詳細な図を提供します。 G タンパク質は開いた空洞構造を必要とするのに対し、β-アレスチンは閉じた構造を好むことを考えると 27、28、29、この空洞のサイズは偏ったアゴニズムにとって極めて重要であると考えられます（図 3g–i および拡張データ図 8a、b）。）。 G タンパク質に偏ったアゴニズムは、クラス B1 GPCR を用いた創薬に有益です。なぜなら、クラス B1 GPCR を介した β-アレスチンの活性化は、一般に初期エンドソームを介して長時間のシグナル伝達を誘導し、それが副作用につながるからです 31。 PCO371 は、Gα サブユニット間で異なる配列を示す Gα の C 末端フックと直接相互作用します。したがって、PCO371の修飾は、Gタンパク質サブタイプ間でさらに選択的な機能を獲得する可能性があります（拡張データ図9e、f）。

クラス B1 GPCR における PCO371 感受性をさらに分析するために、以前に報告された内因性リガンド結合活性クラス B1 GPCR を重ね合わせ、注意深く検査しました。我々は、遺伝的に類似しているが、PCO371に対する感受性が異なる、GCGRと胃抑制ポリペプチド受容体（GIPR）の間のAsn5.50の代替立体構造に注目した（拡張データ図10a、b）。重ね合わせた活性クラスB1 GPCR構造は、PCO371非感受性受容体がTM3に向かって外側のAsn5.50立体構造を採用するのに対し、PCO371感受性受容体は受容体の中心に向かって内向きの立体構造を採用することを示した（図4dおよび拡張データ図10c））。また、PCO371 に結合した PTH1R クライオ EM 構造から開始して 3 つの独立した分子動力学シミュレーションを実行し、PCO371 認識における Asn5.50 の機能を分析しました。これらのシミュレーションは、受容体のTMDがクライオEM構造と同様の活性構造を維持し、PCO371が受容体に安定に結合していることを示した(拡張データ図10d、上の2つのパネル)。 Asn5.50 の立体構造は、PCO371 に結合した PTH1R クライオ EM 構造の位置で安定しており、活性型 GLP-1 に結合した GLP-1R 構造の位置とは異なります (タンパク質データバンク (PDB) 識別子: 6X18) (拡張データ図 10d、下から 2 番目、および 10e)。注目すべきことに、2回目の実行では、受容体は中間状態を示し、PCO371はAsn3745.50との新たな安定した相互作用を作り出した(拡張データ図10d、下、10f、g)。シミュレーションと一致して、N3745.50A PTH1R 変異体は PCO371 誘導性受容体活性化を選択的に減少させましたが、この変異体は PTH 誘導性受容体活性化には影響を及ぼしませんでした (拡張データ図 10h)。これらの結果は、Asn3745.50の側鎖の配向がPCO371の認識に重要であり、側鎖が受容体の中心に向かって配向している場合、Asn3745.50がPCO371に応答できることを示唆しています（拡張データ図10a-c）。分子動力学シミュレーションおよび機能研究と組み合わせると、これらの結果は、Asn5.50 がクラス B1 GPCR の PCO371 認識および感度の決定因子の 1 つであることを示唆しています。将来的には、PCO371 に結合した GCGR の構造により、PCO371 の受容体選択性の包括的な理解が得られる可能性があります。

医薬品開発においては、治療効果と安全性にとって受容体の特異性が非常に重要です。 GPCR では、TMD コアは高い配列類似性を共有していますが、細胞外および細胞内ループは多様な配列を持っています。これらの違いは、アゴニストが受容体の外側に向かってリガンドを伸長することによって受容体選択性を獲得することを示しています 32。我々の構造により、PCO371に結合したPTH1Rの細胞内腔はGによってしっかりと密閉されており、PCO371は細胞内ループと相互作用できないことが明らかになりました（拡張データ図11a、b）。代わりに、PCO371 のリガンド結合ポケットは TM6 と TM7 の間で横に開いており、ヘリックス 8 にアクセスできます (拡張データ図 11b、左)。さらに、我々の構造は、膜領域に面したTM1、TM7、ヘリックス8からなる細胞内ポケットを視覚化しました。ヘリックス8が配列多様性を持っていることを考えると、このポケットに結合したバインダー分子は受容体選択性を提供し、バイトープリガンドの発達につながる可能性があります（拡張データ図11c、d）。さらに、PTH1R は、TM7 とヘリックス 8 を接続する細胞内ループ上の 7.60 位に非保存のシステイン残基を持っています (拡張データ図 11c、右)。 PTH1R、PTH2R、および CALCR のみが 7.60 位にシステイン残基を持ち、PCO371 は CALCR と PTH2R を活性化しないことに注意してください。したがって、ＰＣＯ３７１への共有結合性官能基の付加は、ＰＴＨ１Ｒに対するＰＣＯ３７１受容体選択性を提供する可能性がある。 Cys7.60 の Cβ は PCO371 の O6 から 6.4 Å 離れた位置にあり (拡張データ図 11c、右)、PCO371 と Cys7.60 を接続するには 3 つまたは 4 つの炭素残基で十分です。さらに、以前に報告された GLP-1R 用の共有結合剤 (化合物 2)11 も、bitopic リガンドの生成に有用である可能性があります。化合物 2 は弱い共有結合剤として作用し、Cys3476.36 に選択的に結合します。 PTH1R の TM6、TM7、および Gα によって形成される空洞への化合物 2 の結合を最適化することにより、修飾された化合物 2-PCO371 が PTH1R 選択的アゴニストになる可能性があります。

要約すると、この研究で特定された独特の細胞内トランスデューサーポケットは、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーターの偏った化合物の開発において幅広い可能性を秘めている可能性があります。私たちの発見は、GPCR活性化のメカニズムの全体的な理解を広げ、GPCRを標的とした治療法の設計と開発のための新しい戦略を提供するでしょう。

ヒト PTH1R (GenBank 識別子: U17418.1; 残基 27 ～ 491) をコードするプラスミドは、以前に報告されているように構築および精製されました 17。この構築物を、BacMam システム (Thermo Fisher Scientific) を使用して HEK293 GnTI (N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ I 陰性) 細胞 (American Type Culture Collection、CRL-3022) で発現させ、細胞を FreeStyle 293 培地 (Gibco) で増殖および維持しました。 37 °C、8% CO2、加湿条件下で。 Sf9 細胞 (Life Technologies) で生成したバキュロウイルスを細胞に感染させ、18 時間後にタンパク質発現を高めるために 10 mM 酪酸ナトリウムを添加し、懸濁液中で 30 °C でさらに 48 時間培養したことに注意してください。培養細胞を遠心分離（5,000g、10分間、4℃）によって収集し、低張溶解緩衝液（20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaClおよび20%グリセロール）中で超音波処理によって破壊しました。細胞破片を遠心分離（10,000g、10分間、4℃）により除去した。膜画分を180,000gで1時間超遠心分離して回収し、可溶化緩衝液（20 mM Tris-HCl、pH 9.0、200 mM NaCl、1% LMNG、0.1% CHS、20% グリセロールおよび100 μM PCO371）で可溶化しました。 4℃で2時間。可溶化された受容体を、180,000gで20分間の超遠心分離によって不溶性物質から分離し、Ni-NTA樹脂(Qiagen)とともに30分間インキュベートした。２０カラム容量の洗浄緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０、５００ｍＭＮａＣｌ、０．０３％ＧＤＮ、１０％グリセロール、１００μＭＰＣＯ３７１および３０ｍＭイミダゾール）で洗浄することによって界面活性剤ミセルを置換した。受容体を溶出緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０、５００ｍＭＮａＣｌ、０．０１％ＧＤＮ、１０％グリセロール、１００μＭＰＣＯ３７１および３００ｍＭイミダゾール）中で溶出した。溶出液をTEVプロテアーゼで処理してGFP-His10タグを切断し、透析緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0、500mM NaCl、100μM PCO371および10%グリセロール)に対して透析した。切断された GFP-His10 タグと TEV プロテアーゼを Ni-NTA 樹脂で除去しました。受容体を、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％ＧＤＮおよび１００μＭＰＣＯ３７１）中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ピーク画分を収集し、約 5 mg ml-1 まで濃縮しました。

mini-G をコードするプラスミドは、以前に報告されているように構築および精製されました 34。 Mini-G は大腸菌 (BL21) 細胞で発現されました。細胞を、1 mM イソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシド (IPTG) を添加した LB 培地中で 25 °C で培養しました。 20 時間後、細胞を低張緩衝液 (20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM MgCl2、および 1 μM GDP) 中で超音波処理して破壊し、mini-Gs タンパク質を Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーで精製しました。その後、HiLoad Superdex75 16/600 カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを行いました。

His6 タグが融合したラット Gβ1 およびウシ Gγ2 も、以前に報告されているように構築、発現、精製されました 17。細胞培養物を、Sf900 II 培地 (Gibco) 中で 1 ml あたり 4 × 106 細胞の細胞密度まで 27 °C で 60 時間増殖させました。細胞を遠心分離によって収集し、低張緩衝液中で溶解した。 Gβ1-Gγ2 ヘテロ二量体を Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーで精製し、HiLoad Superdex75 16/600 カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを行いました。

精製したミニ G と Gβ1-Gγ2 を混合し、氷上で一晩インキュベートしました。混合物を濃縮し、Superdex 75 10/300 Increase サイズ排除カラムにロードし、緩衝液 (20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl および 1 μM GDP) で平衡化しました。 mini-Gs ヘテロ三量体を含むピーク画分をプールし、5 mg ml-1 まで濃縮しました。

Nb35 をコードするプラスミドは、以前に報告されているように調製されました 17,35。このタンパク質は、1 mM IPTGを補充したLB培地で25℃で20時間培養した大腸菌C41（ロゼッタ）細胞のペリプラズムで発現しました。 20 時間後、細胞を回収し、低張緩衝液 (20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl および 2 mM MgCl2) 中で超音波処理して破砕し、Nb35 タンパク質を Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーで精製し、 HiLoad Superdex75 16/600 カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー。ピーク画分をプールし、3 mg ml-1 まで濃縮しました。

PCO371 は中外製薬で合成され、その純度と安定性は液体クロマトグラフィー - 質量分析法によって確認されました。精製したＰＣＯ３７１結合ＰＴＨ１Ｒタンパク質を、１．２倍モル過剰のミニＧｓβ１γ２および１．５倍モル過剰のＮｂ３５と混合し、混合物を氷上、ｐＨ９．０で一晩インキュベートした。サンプルを Ni-NTA アフィニティー樹脂を使用して精製し、バッファー (20 mM Tris-HCl、pH 9.0、150 mM NaCl、0.01% GDN および 100 μM PCO371) で平衡化した Superdex 200 10/300 Increase サイズ排除カラムにロードしました。複合体を汚染物質から分離します。 PCO371-PTH1R-mini-Gs ヘテロトリマー-Nb35 複合体のピーク画分をプールし、7 mg ml-1 まで濃縮しました。

精製した複合体を、Vitrobot Mark IV を使用して 4 °C、湿度 100% でグロー放電させたばかりの Quantifoil 穴あきカーボングリッド (R1.2/1.3、Au、300 メッシュ) 上に塗布しました。準備したグリッドを Titan Krios G4 顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) に移し、Gatan Quantum-LS Energy Filter (GIF) およびナノプローブ EFTEM モードの Gatan K3 Summit 直接電子検出器を備え、300 kV の加速電圧で操作しました。画像は、ピクセルあたり 0.83 Å の校正ピクセルサイズに相当する 105 K の公称倍率で収集されました (東京大学、日本)。データセットは、Serial EM (v.3.7.4) ソフトウェアを使用して、焦点ぼけ範囲 -0.8 ～ -1.6 μm で取得されました。各画像は、7.5 e- ピクセル -1 s -1 の線量率で 72 フレームに線量分割され、総線量 54.578 e- Å -2 が蓄積されました。 6,333 の線量分割ムービーは、RELION-3 (参考文献 36) を使用してビーム誘起運動補正を受け、CTFFIND4 (参考文献 37) を使用してコントラスト伝達関数と焦点ぼけパラメータが推定されました。 4,880,293 個の粒子は、最初に RELION-3 のラプラシアンオブガウス抽出機能を使用して 6,333 枚の顕微鏡写真から抽出され、ピクセルあたり 3.63 Å で抽出されました。これらの粒子は、数回の 2D および 3D 分類を受けました。最良のクラスには 109,422 個の粒子が含まれており、その後、ピクセルあたり 1.11 Å のピクセルサイズで再抽出され、3D 精製が行われました。均質なサブセットに対して、粒子ごとの焦点ぼけのリファインメント、ビームチルトのリファインメント、ベイジアン研磨、および 3D リファインメントが施されました。最終的な 3D 改良と後処理により、フーリエシェル相関 = 0.143 基準に従って 2.9 Å のグローバル解像度のマップが生成されました。処理戦略は拡張データの図 2 で説明されています。

PTH1R-Gs-Nb35 複合体の最初のテンプレートは PTH-PTH1R-Gs-Nb35 構造 (PDB 識別子: 7VVL) に由来し、その後 COOT-0.9.3 EL38 を使用して大規模なリモデリングが行われました。 PCO371 – PTH1R – G のモデルは、COOT を使用して手動で再調整され、作業マップに対して phenix.real_space_refine (v.1.14-3260)39 REFMAC540 および Servalcat41 を使用して洗練され、MolProbity42 で検証されました。

このシステムには、PTH1R、PCO371、1-ホスホリル-2-オレオイルホスファチジルコリン (POPC)、TIP3P 水、および 150 mM NaCl が含まれていました。アミノ酸 27 ～ 491 を含む PTH1R の初期モデルは、PCO371 と複合した PTH1R のクライオ EM 構造をテンプレートとして MODELLER (v.10.1)43 を使用して作成されました。欠落している水素原子は、プログラム VMD (v.1.9.3)44 を使用して構築されました。タンパク質は、MemProtMD パイプライン 45 を使用して POPC 膜に埋め込まれました。シミュレーションシステムの正味電荷は、150 mM NaCl の添加によって中和されました。シミュレーションシステムは 96 × 96 × 180 Å3 で、123,567 個の原子が含まれていました。 Charmm36 力場 46 からの分子トポロジーとパラメーターが、タンパク質、脂質、水分子に使用されました。 PCO371 の分子トポロジーとパラメーターは、CHARMM-GUI リガンドリーダーとモデラーを使用して作成されました 47,48。

分子動力学シミュレーションは、プログラム NAMD (v.2.13) を使用して実行されました。シミュレーションシステムは、非水素原子の位置を固定して 1,000 ステップにわたってエネルギーが最小化されました。最小化後、タンパク質の 5.0 Å 以内の脂質分子を除き、非水素原子に対して 10 kcal mol-1 の制限を設けてエネルギー最小化のさらに 1,000 ステップを実行しました。次に、タンパク質の重原子を 10 kcal mol-1 Å-2 に制限して、NVT 条件下で平衡化を 0.1 ns 実行しました。最後に、タンパク質のすべての Cα 原子に対して 1.0 kcal mol-1 Å-2 の制限を設けて、NPT 条件下で平衡化を 2.0 ns 実行しました。生産運転は、ランジュバン力学を使用して 310 K で一定温度を維持し、ノーゼ・フーバーランジュバンピストンを使用して 1 気圧で一定圧力を維持しながら、制限なしで 200 ns 実行されました。長距離静電相互作用は、粒子メッシュ Ewald 法 50 を使用して計算されました。シミュレーションは独立して 3 回実行されました。シミュレーション結果は、mdtraj (v.1.9.8)51、seaborn (https://zenodo.org/record/54844)、および CUEMOL (v.2.2.3.443) (http://www.cuemol.組織）。

PTH1R 誘導性 Gs 活性化は、GloSensor cAMP 蓄積アッセイを使用して測定されました。我々はまず、ヒト全長PTH1R遺伝子が、先行する赤血球凝集素由来のシグナル配列を有するFlagエピトープタグにN末端で融合されたプラスミドを構築した。 HEK293A 細胞を、10% FBS (Sigma、F7524、ロット 0001641439) およびペニシリン - ストレプトマイシン - を添加した DMEM (日水製薬) に 1 ml あたり 2 × 105 細胞の濃度で 6 cm 培養皿に播種しました (ウェルあたり 4 ml)。グルタミン (完全 DMEM)) トランスフェクション 1 日前。トランスフェクション溶液は、1 mg ml-1 ポリエチレンイミン MAX (Polysciences) 溶液 10 μl (以下、ウェルあたり) と、1,000 ng Glo-22F cAMP バイオセンサー (ヒトコドン最適化および遺伝子合成) からなるプラスミド混合物を混合することによって調製しました。 400 μl の Opti-MEM (ThermoFisher Scientific) に pCAGGS プラスミドと 400 ng Flag-PTH1R プラスミドをコード化します。 24時間インキュベートした後、トランスフェクトされた細胞を0.53 mM EDTA含有ダルベッコPBS (D-PBS) を使用して収集し、遠心分離し、0.01% BSA (脂肪酸フリーグレード; SERVA) および5 mM HEPESを含む2 mlのHBSSに懸濁しました。 (pH 7.4) (アッセイバッファー)。細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに４０μｌ／ウェルで分注し、アッセイバッファーで希釈した１０ｍＭｄ－ルシフェリンカリウム溶液（富士フイルム和光純薬）１０μｌを加えた。室温で2時間インキュベートした後、プレートのベースライン発光(2PMTを備えたSpectraMax L、Molecular Devices; SoftMax Pro (v.7.03)、Molecular Devices)およびアッセイバッファーで希釈した20μlの6×リガンドを測定しました。アッセイバッファーのみ（ビヒクル）を手動で添加しました。プレートを室温で 30 秒間隔で 20 分間読み取りました。リガンド添加後 8 ～ 10 分間の発光カウントを平均して初期カウントに対して正規化し、ビヒクル処理によるシグナルの変化倍数をさらにフォルスコリン (10 μM) に対して正規化し、cAMP 蓄積応答についてプロットしました。 Prism 9 ソフトウェア (GraphPad) を使用して、非線形回帰を使用して応答をすべてのデータに適合させました。絶対値が 2 未満のヒルスロープの制約を持つ Prism 9 ツールの可変スロープ (4 つのパラメーター) が使用されました。 pEC50 および Emax 値は、平均データの非線形回帰曲線から得られました。多重比較分析では、一元配置または二元配置 ANOVA とそれに続くダネット検定が使用されました。

PTH1R への β-アレスチン動員は、NanoBiT β-アレスチン動員アッセイ 52 に若干の変更を加えて測定しました。簡単に説明すると、200 ngのN末端ラージBiT融合β-アレスチン1（Lg-β-アレスチン1）またはLg-β-アレスチン2と1,000 ngのCの混合物を用いて、6 cm培養皿でプラスミドトランスフェクションを実行しました。 -末端小型 BiT 融合 PTH1R (PTH1R-Sm) プラスミド。 24時間のインキュベーション後、トランスフェクトされた細胞を0.53 mM EDTA含有D-PBSを使用して収集し、190gで5分間遠心分離し、GloSensorアッセイについて記載したアッセイ緩衝液4 mlに懸濁した。細胞懸濁液を白色の９６ウェルプレート（以下、９６ウェルプレート）に１ウェルあたり８０μｌの量で分注し、アッセイ緩衝液で希釈した５０μＭセレンテラジン（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）２０μｌをロードした。室温で2時間インキュベートした後、プレートのベースライン発光(2PMTを備えたSpectraMax L、Molecular Devices; SoftMax Pro (v.7.03)、Molecular Devices)およびアッセイバッファーで希釈した20μlの6×リガンドを測定しました。車両は手動で追加されました。プレートを室温で 40 秒間隔で 15 分間読み取りました。リガンド添加後 13 ～ 15 分の発光カウントを平均し、初期カウントに対して正規化しました。 GloSensor アッセイについて説明したのと同じ手順を使用して、応答をすべてのデータに当てはめました。

PTH1R の細胞表面発現は、以前に記載されたフローサイトメトリー法 17 を使用して測定されました。簡単に説明すると、トランスフェクションの 1 日前に、HEK293A 細胞を 1 ml あたり 2 × 105 細胞の濃度で 6 ウェル培養プレートに播種しました。トランスフェクションは、GloSensor アッセイで説明したのと同じ手順を使用して実行されました。トランスフェクションの１日後、１００μｌの０．５３ｍＭＥＤＴＡ含有Ｄ－ＰＢＳを添加し、次いで１００μｌのＨＢＳＳを含有する５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を添加することによって細胞を回収した。細胞懸濁液を 96 ウェル V 底プレートに移し、抗 Flag エピトープ (DYKDDDDK) タグモノクローナル抗体 (クローン 1E6、富士フイルム和光純薬、2% ヤギ血清で希釈した 10 μg ml-1) で蛍光標識しました。 2 mM EDTA 含有 D-PBS (ブロッキングバッファー) および Alexa Fluor 488 (1:200) と結合したヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体 (ThermoFisher Scientific、10 μg ml-1 をブロッキングバッファーで希釈) D-PBSで洗浄後、細胞を2 mM EDTA含有D-PBS 100μlに再懸濁し、40μmフィルターで濾過し、フローサイトメーター（EC800搭載）を用いて単一細胞の蛍光強度を定量した。 Alexa Fluor 488 由来の蛍光シグナルは FL1 チャネルで記録され、フローサイトメトリーデータは FlowJo 10 ソフトウェア (FlowJo) を使用して分析されました。生細胞は前方散乱光でゲート制御されました (FS- Peak-Lin) カットオフ (390 設定、ゲイン値 1.7) サンプルあたり約 20,000 個の細胞からの平均蛍光強度の値を分析に使用しました。

トランスフェクションは、500 ng mVenus-β-arrestin 2 プラスミドと 200 ng Flag-PTH1R プラスミドの混合物 (6 cm ディッシュのウェルあたり) を使用して実行されました。 1 日間のインキュベーション後、トランスフェクトされた細胞を収集し、35 mm のコラーゲンでコーティングされたガラス底ディッシュ (matsunami) に再播種しました。 1日後、培地をフェノールレッドおよびFBS（飢餓緩衝液）を含まないDMEMに交換した。 1 時間のインキュベーション後、細胞を Alexa-647 標識 (1:2,000) Flag-M1 抗体とともに 1 時間インキュベートし、飢餓バッファーで 1 回洗浄し、共焦点顕微鏡にセットしました。生細胞イメージングは、×100/1.46 alpha-Plan-Apochromat 油浸レンズおよび ImmersolTM 518F/37 °C (444970-9010-000、Zeiss) を備えた Airyscan (Zeiss) を備えた LSM880 を使用して実行されました。生細胞イメージング中、ディッシュはチャンバー (STXG-WSKMX-SET、TOKAI HIT) に取り付けられ、37 °C、5% CO2 のインキュベーション条件を維持しました。次の設定で 2 色のタイムラプス画像を撮影しました。時間間隔は 5 分、時間間隔は 5 分です。合計時間35分。 0.01% BSA-HBSS 中の 200 µl のリガンド溶液を時点 1 と時点 2 の間に加えました。取得した連続画像は、Zeiss ZEN 2.3 SP1 FP3 (黒、64 ビット) (v.14.0.21.201) を使用して Airyscan 処理しました。共局在解析はフィジー (v.2.0.0-rc-69/1.52p) を使用して実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

PCO371 に結合した PTH1R-mini-Gsβ1γ2-Nb35 複合体の原子座標は、アクセッションコード 8GW8 で PDB に登録されています。関連する電子顕微鏡データは、アクセッションコード EMD-34305 で電子顕微鏡データバンクに保管されています。他のすべてのデータはこの文書に付属しています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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クライオ EM インフラストラクチャをセットアップしてくれた R. Danev と M. Kikkawa に感謝します。 K. Ogomori 技術協力。プラスミドの調製と細胞ベースの GPCR アッセイについては、東北大学の K.Sato、S.Kanano、A.Inoue にご協力いただきました。モデル検証については K. ヤマシタ。本研究は、JSPS 科研費 JP20J21820 (K.小林)、JP21H05037 (ON)、JP21H04791 (AI)、JP21H05113 (AI)、JP18H05425 (TM)、JPJSBP120213501 (AI) および JPJSBP120218801 (AI) の支援を受けました。日本医療研究開発機構 (AMED) の JP19gm5910013、JP20gm0010004、JP20am0101095、JP22ama121038 および JP22zf0127007 (AI)。 JP22am0101115、JP22ama121002 (サポート番号 3272)、JP22ama121012 (サポート番号 4826)、および JP233fa627001 (ON)。科学技術振興機構 (JST) の JPMJFR215T および JPMJMS2023 (AI)。 JST CREST プログラム 20344981 (ON); 武田科学財団（AI）、上原記念財団（AI）。公益財団法人東京生化学研究財団（AI）第一三共ライフサイエンス財団（AI）。中外製薬からの研究助成金（AI、TM、ON）。分子グラフィックスと分析は、米国国立衛生研究所 (R01-GM129325) およびサイバーインフラストラクチャ局の支援を受けて、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のバイオコンピューティング、可視化、および情報学のリソースによって開発された UCSF ChimeraX 1.0 を使用して実行されました。国立アレルギー感染症研究所の計算生物学。

Atsuhiro Tomita

現在の住所：Preferred Networks、東京、日本

これらの著者は同様に貢献しました: 小林一弘、川上幸樹

東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻

Kazuhiro Kobayashi, Tsukasa Kusakizako, Atsuhiro Tomita, Michihiro Nishimura, Kazuhiro Sawada, Hiroyuki H. Okamoto & Osamu Nureki

東北大学大学院薬学研究科（仙台市）

Kouki Kawakami, Suzune Hiratsuka, Gaku Nakamura, Riku Kuwabara & Asuka Inoue

中外製薬研究部（静岡県）

Hiroshi Noda, Hiroyasu Muramatsu & Masaru Shimizu

東北大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻オルガネラ病態生理学研究室

Tomohiko Taguchi

千葉大学大学院理学研究科化学専攻

Takeshi Murata

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実験全体を設計したのは小林和樹氏。小林和夫 KS と HHO がプラスミドを構築し、精製しました。 K.小林は、mini-Gsヘテロ三量体、Nb35およびPCO371に結合したPTH1Rを精製し、複合体およびクライオEMグリッドを調製しました。 K.小林、K.川上、SH、HN が変異アッセイと解析を実施しました。 HM と MS は生物学的専門知識に基づいて分析を実行し、このプログラムを指揮しました。 K.小林とTKはクライオEMデータを収集し、K.小林はクライオEMデータを処理しました。 K.Kobashi はモデルを構築し、モデリングと改良を実行しました。 ATは分子動力学シミュレーションのシステムを設計しました。 AT と小林 K. は分子動力学シミュレーションを実行し、解析しました。小林 K. が最初の原稿を準備し、小林 K.、川上 K.、AT、TK、MN が著者全員の意見を取り入れて原稿を執筆しました。 TK、AI、TM、ON が研究を監督しました。

Correspondence to Asuka Inoue, Takeshi Murata or Osamu Nureki.

ON は Curreio Inc. の共同創設者であり、社外取締役です。HN、HM、MS は中外製薬の従業員です。他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Sudarshan Rajagopal と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

PTH および PCO371 による刺激時の PTH1R の GloSensor cAMP 応答の pH 感受性。アッセイバッファー (「方法」も参照) を指定の pH に調整したことに注意してください。記号と誤差バーは、それぞれ 2 回実行した 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。

(a) PCO371-PTH1R-Gs データセットの 6,333 画像からの代表的な顕微鏡写真。PCO371-PTH1R-Gs 粒子の分布を示しています。 (b) 二次構造の特徴を示す代表的な二次元クラス平均。円形窓の直径は 18 nm です。 (c) 3D 分類後の PCO371 – PTH1R – Gs 複合体のデータ処理ワークフロー。 (d) ゴールドスタンダードのフーリエシェル相関 (FSC) 曲線。2.9 Å での全体的なグローバル解像度を示します。

(a) PTH1R および PCO371 の Cryo-EM 密度マップとモデル。 (b) 2 つのハーフマップを使用した各洗練されたモデルの相互検証。洗練されたモデルのオーバーフィッティングは、以前に説明された相互検証方法 53 を使用してテストされました。

（a）PCO371-PTH1R-Gs複合体と内因性ペプチド結合およびオルソステリック化学アゴニスト結合クラスB1 GPCR複合体との比較。オルソステリック化学アゴニスト結合 PTH1R 構造の構造は存在しないため、LY3502970 (独自の GLP-1 受容体アゴニスト)-GLP-1R-G を使用して、オルソステリック化学アゴニスト結合クラス B1 GPCR の構造を表しました。直交ビューとモデルは、PTH–PTH1R–G (PDB: 7VVL)、PCO371–PTH1R–G (8GW8)、および LY3502970–GLP-1R–G (PDB: 6XOX) を示しています。緑色、PTH 結合 PTH1R。オレンジ、PTH; 黄色のミニ Gs Ras 様ドメイン。トマト、Gβ1; ネイビー、Gγ2。パウダーブルー、Nb35; 紫、PCO371 結合 PTH1R。深紅色、LY3502970結合GLP-1R。スカイブルー、LY3502970。グレー、PTH-PTH1R-G; バイオレット、PCO371–PTH1R–Gs; 赤、LY3502970–GLP-1R–G。 PTH 結合 PTH1R および LY3502970 結合 GLP-1R マップとは対照的に、PCO371 結合 PTH1R マップは、オルソステリックポケット内に明らかなリガンド様密度を示しません。 (b) 内因性ペプチド結合 PTH1R および GLP-1R 構造、ならびに化学アゴニスト結合 GLP-1R 構造の断面図。緑色、PTH 結合 PTH1R。オレンジ、PTH; 白、GLP-1R; 黄緑色、GLP-1。紫、PCO371 結合 PTH1R。クリムゾン、PCO371; 黄色、CHU-128結合GLP-1R。青紫、CHU-128。紫色のダヌグリプロン (PF-06882961) 結合 GLP-1R。カーキ、PF-06882961; 赤色、LY3502970結合GLP-1R。スカイブルー、LY3502970。 PCO371 のみが細胞内腔内で結合しますが、他のアゴニストはさまざまな方法でオルソステリックポケットに結合します。

(a) 4 つの活性型クラス B1 GPCR (緑色、PTH1R、白色、GLP-1R、ピンク色、グルカゴン受容体 [GCGR]、紫色、コルチコトロピン放出因子受容体 1 [CRF1R]) が、不活性または不活性様構造上に重ねられています。 (b) PTH 結合 PTH1R および PCO371 結合 PTH1R は、ePTH 結合不活性様 PTH1R 構造上に重ねられます (緑色、PTH 結合 PTH1R、オレンジ、PTH、紫、PCO371 結合 PTH1R、マゼンタ、PCO371、灰色、ePTH) -結合PTH1R)。 PCO371 結合 PTH1R は TM6 で中程度のキンク (約 145°) を示しましたが、PTH 結合 PTH1R は TM6 で典型的な鋭いキンク (約 90°) を示しました。 (c) I/M/V6.39、G6.50、および A/V/L6.54 残基の 3 つの Cα 原子からなる TM6 角度。 (d) PCO371 は、TM6 の細胞内半分を外側の立体構造で直接安定化し、内腔の体積を増加させ、Gs タンパク質を活性化します。

(a) PCO371 結合 PTH1R の TMD 領域。目と四角は (c ～ h) のビューを示します。（b）結合PTH結合活性PTH1R（左、紫）、PCO371-PTH1R（中央、緑色）、およびePTH結合不活性PTH1R（右、灰色）の中心極性ネットワーク。（ c – h ）PTH結合PTH1R（緑色）、PCO371-PTH1R（紫）、およびePTH結合PTH1R（灰色）の重ね合わせ構造が膜に平行に示されています。 PYQ アクティブモチーフと PxxG アクティブスイッチの拡大図 (c ～ d および f ～ g)。 HETY 不活性モチーフの拡大図 (e および h)。 (i) PCO371 (深紅) と ePTH 結合 PTH1R の重ね合わせ構造。

図 3d に関連します。（ a – c ）GloSensor cAMP蓄積アッセイによって測定されたPTH1R誘導性Gs活性化、およびフローサイトメトリー分析によって評価されたWTおよび変異体PTH1Rの細胞表面発現。 (a) PTH または PCO371 刺激時の WT PTH1R またはモックトランスフェクト細胞における GloSensor cAMP 応答の濃度応答曲線。記号と誤差バーは、それぞれ 2 回実行した 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。 (b) 細胞表面発現。記号と誤差バーはそれぞれ平均値と SEM を表し、点はそれぞれを 2 回実行した 4 つの独立した実験の個々のデータを示します。統計分析は、一元配置分散分析と、その後の多重比較分析のためのダネット検定によって実行されました (WT を参照)。 ns、グループ間で有意な差はありません。（ c ）PTH（青）またはPCO371（赤）刺激時のWT（破線）および変異体（実線）PTH1RのGloSensor cAMP応答の濃度応答曲線。記号と誤差バーは、それぞれ 2 回実行した 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。

(a) PCO371 に結合した PTH1R (紫) および PCO371 (深紅) の TMD 構造が膜に平行に示されています。 (b) TM 2～5 上に並べた、PCO371 – PTH1R – G およびフォルモテロール – β1AR – β-アレスチン複合体の重ね合わせ構造。 PCO371 は、TM6 の細胞内部分の外側の立体構造を促進し、β-アレスチンと衝突します。（ c ）Alexa-647標識PTH1R（マゼンタ）およびmVenus融合β-アレスチン2（緑色）の細胞局在の代表的な画像。図3gに関連する。これらの画像は、これらの実験の 10 ～ 19 枚の画像から得られました。（ d ）内因性ペプチドアゴニスト（青）またはPCO371（赤）刺激時の15種類のクラスB1 GPCRのGloSensor cAMP応答の濃度応答曲線。以下の内因性ペプチドアゴニストが各 GPCR に使用されました。 PTH (1-34)、PTH2R: 成長ホルモン放出ホルモン、GHRHR。セクレチン、SCTR; 下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド (PACAP、1 ～ 27)、VIP1R および VIP2R。 PACAP (1–38)、PAC1R; グルカゴン、GCGR; 胃抑制ポリペプチド、GIPR。グルカゴン様ペプチド 2、GLP-2R; グルカゴン様ペプチド 1、GLP-1R; 副腎皮質刺激ホルモン放出因子、CRF1R および CRF2R。カルシトニン、CALCR; カルシトニン遺伝子関連ペプチド、CALRL。すべてのペプチドはヒト由来の配列です。記号と誤差バーは、それぞれ 2 回実行した 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。（ e ）フローサイトメトリー分析によって評価されたWTおよび変異体PTH2Rの細胞表面発現。記号と誤差バーはそれぞれ平均値と SEM を表し、点はそれぞれを 2 回実行した 4 つの独立した実験の個々のデータを示します。統計分析は両側 t 検定によって実行されました。 ns、グループ間で有意な差はありません。

(a) PCO371 に結合した PTH1R と 6 つの細胞内リガンド結合 GPCR の TMD 構造を膜に平行に、または細胞内側から示します。バイオレット、PCO371 結合 PTH1R。マゼンタ、PCO371; オレンジ色、化合物 2 結合 GLP-1R。青、化合物 2、黄色、CC モチーフケモカイン受容体 (CCR2)-RA-[R] 結合 CCR2。バイオレット、CCR2-RA-[R]; 黄緑色、cmpd2105結合CCR7。プラム、cmpd2105; 緑色、バーシル非結合CCR6。茶色、バーシルノン。パウダーブルー、cmpd-15PA結合β2AR。サンゴ、cmpd-15PA。明るいシアン、cmpd-6FA結合β2AR。ゴールド、cmpd-6FA。 (b、c) 化合物 2 結合 GLP-1R、GLP-1 結合 GLP-1R、LY3502970 結合 GLP-1R、および不活性型 GLP-1R の重ね合わせ構造。白色、GLP-1結合GLP-1R。カーキ、GLP-1; 赤、LY3502970 結合 GLP-1R。スカイブルー、LY3502970; 灰色、不活性な GLP-1R。 Compound2 は TM6 の細胞内部分と結合し、Compound2 に結合した GLP-1R は TM6 と同一の活性構造を示します。（ d ）内因性アゴニスト（PTHまたはグルカゴン）またはPCO371刺激時の野生型（WT）PTH1RおよびTM6置換変異体におけるGloSensor cAMP応答。記号と誤差バーは、それぞれ 2 回実行した 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。（ e ）PCO371-PTH1R-Gの断面図とPCO371-Gタンパク質界面の拡大図。 PCO371 と相互作用する Gαs 領域はオレンジ色に色付けされています。 (f) Gα タンパク質の C 末端フックの配列アラインメント。

(a) PCO371 結合 PTH1R の断面図。 (b) PCO371 に結合した PTH1R (紫)、GCG に結合した GCGR (オレンジ)、および GIP に結合した GIPR (灰色) の重ね合わせ構造の拡大図。（c）図4dに関連する、PCO371非感受性受容体とPCO371感受性受容体のN5.50の構造比較。バイオレット、PCO371 結合 PTH1R。灰色、PCO371 非感受性受容体。オレンジ色の PCO371 感受性受容体。 (d) PCO371 結合 PTH1R を使用した 3 つの独立したシミュレーションの軌跡分析。上の 2 つのパネルは、PCO371 に結合した PTH1R が活性構造を維持し、クライオ EM 構造に似ていることを示しています。下から 2 番目のパネルは N3745.50 の上反角を示しています。 PCO371 に結合した PTH1R (青) と GLP-1R (赤) の角度を破線で示します。下のパネルは、N3745.50-ND2 と PCO371-O1 の間の距離を示しており、中間状態にある PCO371 と N3745.50 の安定した相互作用を示しています。（ e ）PCO371結合PTH1RとGLP-1結合活性GLP-1Rの間のN3745.50の異なる立体構造（PDB ID：6X18）。二面角は、N5.50 の N-Cα 角度と Cβ-Cγ 角度を使用して計算されます。 (f) クライオ EM 構造 (紫色) と、PCO371 結合 PTH1R の実行 2 における 1.5 μs MD シミュレーションの代表的なスナップショット (黄色) の重ね合わせ。シミュレーションでは、受容体は中間構造を採用し、PCO371 は TM5 に向かって移動しました。 (g) シミュレーションで観察されたクライオ EM 構造 (紫色) と中間構造 (黄色) の比較。 PCO371 は、当社のクライオ EM 構造では N3745.50 と相互作用しませんが、シミュレーションでは N3745.50 と安定した相互作用を生み出します。 (h) PTH および PCO371 を含む WT および N3745.50A 変異体の cAMP 蓄積。 N3745.50A 変異体は、PCO371 応答を選択的に低下させました。記号と誤差バーはそれぞれ平均と SEM を表し、点はそれぞれ 2 回実行された 3 つの独立した実験の個別のデータを示します。 * および ** は、それぞれ P < 0.05 および 0.01 を表し、二元配置分散分析とそれに続く多重比較分析のダネット検定を使用します。 ns、グループ間で有意な差はありません。

(a) PCO371-PTH1R-G の TMD 構造は膜に平行に示されています。 (b、c) TMD の断面図と拡大図。白い破線の円は、TM1、TM7、および Helix8 を含む細胞内リガンド結合ポケットを示します (左パネル)。白い破線は、Cys7.60のCβとPCO371のO6の間の距離を示しています。 (d) TM7 後の C 末端領域の配列アラインメント。赤枠はPTH1RのC4627.60を示しています。

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転載と許可

小林和樹、川上和也、草木迫隆他細胞内アゴニストによるクラス B1 GPCR の活性化。自然 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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受信日: 2022 年 9 月 26 日

受理日: 2023 年 5 月 4 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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