タンパク質フォールドスイッチングネットワークの設計と特性評価

Nature Communications volume 14、記事番号: 431 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

アミノ酸配列がどのようにタンパク質構造をコードするかをより深く理解するために、我々は、3 つの共通のフォールド (3α、β-grasp、および α/β-plait) を接続する変異経路を設計しました。経路（ノード）内の配列同一性の高い交差点におけるタンパク質の構造は、NMR 分光法を使用して決定され、安定性と機能が分析されました。ノードを生成するには、より小さいフォールドをコードするアミノ酸配列を最大 50% 大きいフォールドの構造に埋め込み、2 セットのネイティブ相互作用と互換性のある新しい配列を設計します。これにより、小さい形では 3α または β グリップフォールドを持ち、大きい形では α/β プレイトフォールドを持つタンパク質ペアが生成されます。さらに、小さな拮抗的なフォールドを埋め込むと、単一のアミノ酸置換によりフォールドと機能の両方を切り替えることができるように、大きなフォールドに臨界状態が作成されます。この結果は、タンパク質の折り畳みコードの根底にある曖昧さを説明するのに役立ち、突然の折り畳みスイッチングを介して新しいタンパク質構造が進化する可能性があることを示しています。

最近、一次アミノ酸配列からタンパク質の三次構造を予測する能力 1,2 や、安定した独自のタンパク質構造をコードするアミノ酸配列を設計する能力において、目覚ましい進歩が見られます 3。しかし、一部のタンパク質は 2 つの完全に異なる、しかし秩序立った立体構造になる傾向があることも十分に確立されています 4、5、6、7、8、9、10、11、12。タンパク質の折り畳みコードの曖昧さに対する洞察が深まると、タンパク質がどのように進化するか、突然変異が疾患にどのように関連するか、未知の構造の配列にどのように機能の注釈が付けられるかについてのより良い理解が得られるでしょう13、14、15、16、17、18。 19、20、21、22、23、24、25、26、27。タンパク質の折り畳みコードが真に理解されれば、立体構造が大きく切り替わるタンパク質の予測と設計の両方が可能になるでしょう。フォールドを切り替える天然タンパク質の理解 11 と、アミノ酸配列データから天然のフォールドスイッチングタンパク質を予測する 25 においては、大きな進歩が見られました。異なるフォールド間の界面でタンパク質を設計することは可能であったが 7,28,29,30 、依然として手強い課題を抱えている。四次構造を変えることなく折り畳みを切り替える単量体タンパク質を設計することは特に困難であり、タンパク質内相互作用の非常に限られたサブセットがどのようにしてある折り畳みと機能のバランスを傾けて別の折り畳みに機能させることができるかについて、より深い理解が必要です29,31。 32.

ここでの私たちの目標は、2 つの異なるフォールドの間で臨界状態にある単量体タンパク質を操作することでした。これを行うために、我々はよく研究されたタンパク質フォールドを 3 つ選択し、各配列が 2 セットのネイティブ相互作用と互換性があるように一連の配列を設計しました。これらのフォールドのうち 2 つは、血液中の血清タンパク質に結合する 2 種類のドメインを含む連鎖球菌プロテイン G に由来します。GA ドメインはヒト血清アルブミン (HSA) に結合し 33,34、GB ドメインはヒト血清アルブミンの定常 (Fc) 領域に結合します。 IgG35、36。 3 番目のタンパク質は S6 で、Thermus Thermophilus の 30S リボソームサブユニットの構成要素です 37、38、39、40、41。簡単にするために、S6 折りを S 折り、GA 折りを A 折り、GB 折りを B 折りと呼びます。これらのタンパク質には有意な配列相同性はなく、最も一般的な 10 の折り目のうち 3 つを代表しています。S 折り目はチオレドキシン様の α/β ひだです。 Aフォールドはホメオドメインのような3αヘリックスの束です。そしてBフォールドはユビキチン様βグリップです42。

図 1 は、3 つのフォールドを接続する高同一性配列交差 (ノード) のネットワークを示しています。図 1 の矢印は、天然の S6 シーケンスに由来するネットワークを示しています。円は、構造的および/または機能的な切り替えが発生するネットワーク内のノードを表します。 SI ノードと S'I ノードは分岐点であり、分岐配列経路を下っていき、1 つは A フォールド (S/A) を持つノードに、もう 1 つは B フォールド (S/B) を持つノードにつながります。交差する変異経路は、S/A からネイティブ GA タンパク質に、S/B からネイティブ GB タンパク質につながります。この交差点 (A/B) で、A 折りが B 折りに切り替わります。

S6 はエンジニアリングプロセスにおける原点シーケンスです。 SI と S'I は別個のノードであり、S フォールドのループサイズの変異体であり、両方ともプロテアーゼ阻害剤機能を持っています。突然変異経路の SI 分岐は、A フォールドおよび HSA 結合機能を持つノードにつながります。パスの S'I 分岐は、B フォールドおよび IgG 結合機能を備えたノードにつながります。 S/A ノード (青丸と赤丸) には、タンパク質 Sa1、Sa2、A1、および A2 が含まれています。 S/B ノード (青と緑の円) には、タンパク質 Sb3、Sb4、Sb5、B3、および B4 が含まれます。 A パスと B パス自体は、A/B ノード (緑と赤の円) で交差します。このノードでは、A フォールドと B フォールドがほぼ等エネルギーで二機能性になります。 S および S' 分岐は継続し、α/β 編組スーパーフォールドファミリーの他の多くの天然配列と接続します。

A/B ノード周囲のタンパク質は、我々の以前の研究で広範囲に特徴付けられています 29,31,32。今回我々は、GAとGBの両方が第3の折り畳み(α/β-ひだ)に切り替わることができることを確認し、これらの3つの折り畳みと4つの機能(HSA結合、IgG結合、プロテアーゼ阻害、およびRNA結合)が関連付けられることを示す。展開されて機能しない状態を回避するネットワーク。これらのノードがどのように操作されたかを説明し、NMR 分光法を使用して主要な構造を決定し、安定性と結合機能を分析します。 3 つの一般的な小さな折り畳みを接続するノードを設計して特徴付けることができることは、折り畳みスイッチングがタンパク質の折り畳みコードの本質的な特徴である可能性があり、タンパク質の構造と機能の進化において重要であることを示唆しています。

S6 リボソームタンパク質は、プロドメインとして知られるズブチリシンプロテアーゼ阻害剤と構造的に相同です (図 2a、b)43、44。プロドメインタイプの阻害剤には、プロテアーゼとの 2 つの結合面があります。 1 つの表面は、プロテアーゼの基質結合溝に結合する阻害剤の最後の 9 つの C 末端アミノ酸を含みます (図 2b)。 2 番目のより動的な表面は、阻害剤の α/β 編組トポロジーにおける 2 つのズブチリシンヘリックスと β シートの大きな表面の間に形成されます (図 2b)45、46、47。その結果、S6タンパク質は、その9つのC末端アミノ酸をズブチリシンの基質結合溝に結合するように最適化された残基で置換することにより、全体的に同じフォールド（SIと表記）のズブチリシン阻害タンパク質に変換することができた。この置換により、SI βシートとズブチリシン表面ヘリックスの間に新たな接触が生じます（図2b）。

a 30S リボソーム内の S6 タンパク質 (黄色)、RNA (水色)、および S15 および S18 タンパク質 (青色) の構造 (PDB 1FKA [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb]、参考文献 43) ）。 S6 の C 末端アミノ酸はマゼンタです。 b サブチリシン (小麦) は、SI 阻害剤のモデル (黄色) と複合体で示されています。 SI の C 末端の 9 個のアミノ酸はマゼンタで示されています。これらの位置は、サブチリシンに対する親和性を生成するためにネイティブ S6 で突然変異しました。 S'I 阻害剤 (ティール) も、変更されたループとともに赤色で示されています。モデリングに使用されたズブチリシンは、人工的に作られた RAS 特異的プロテアーゼでした。 c Sa1タンパク質（青と緑）は、45の位置を変異させることによってSIから生成されました（変異側鎖は棒で示されています）。 C末端アミノ酸(青)を欠失させると、Sa1がAフォールド(緑)に切り替わります。 d Sb3タンパク質（ローズおよびシアン）は、67の位置を変異させることによってS'Iから生成されました（変異側鎖は棒で示されています）。 C 末端アミノ酸 (シアン) の欠失または点突然変異により、Sb3 が B フォールド (ローズ) に切り替わります。 e サブチリシン (小麦) に結合した Sa2I (緑と青) のモデル。 HSA (紫) に結合した A2 (A1 構造に基づく) のモデル。 HSA コンプレックスは、PDB 2VDB (ref. 50) をテンプレートとして使用しました。 f スブチリシン (小麦) に結合した Sb3 (ローズとシアン) のモデル。 Fc (ミント) に結合した B4 (ローズ) のモデル。 Fc複合体は、PDB 1FCC (参考文献51)をテンプレートとして使用した。モデリングと阻害測定に使用したズブチリシンは、操作された RAS 特異的プロテアーゼ PDB 6UAO でした (参考文献 49)。

SI タンパク質は長さが 99 アミノ酸で、β2 と β3 の間に 10 残基のループがあります。しかし、保存されたα/β-ひだトポロジーにおけるループの長さには、多くの自然な変動が存在します48。したがって、我々はまた、天然のプロドメイン阻害剤のトポロジーに似ているSフォールドの91アミノ酸バージョン（S'Iと示される）を操作しました（補足図1）。具体的には、S'I阻害剤は、β1とα1を接続する長いループと、β2とβ3を接続する短いターンを持っています（図2b）。

SI および S'I タンパク質は、プロテアーゼカラムに結合することによって発現および精製されました 49。 CD スペクトルを天然の S6 タンパク質と比較しました (補足図 1)。阻害定数 (KI) は、操作された RAS 特異的ズブチリシンプロテアーゼとペプチド基質 QEEYSAM-AMC49 を使用して測定されました。 SI および S'I は、それぞれ 200 および 60 nM の KI 値で RAS 特異的プロテアーゼを阻害します (補足表 1)。競合阻害アッセイの詳細は「方法」セクションに記載されています。この結果は、リボソームタンパク質をわずかな修飾で (フォールドスイッチなしで) プロテアーゼ阻害剤に変換できることを示しています。しかし、さらに、SI および S'I タンパク質は、S、A、および B フォールドのそれぞれを、容易に測定できる結合機能、つまりプロテアーゼ阻害 (S または S' -折り畳み）; HSA 結合 (A フォールド、図 2e)50; および IgG 結合 (B フォールド、図 2f)51。

以前の研究では、A 配列を B フォールドに通し、有望なアラインメントを見つけ、ファージディスプレイ選択を使用して 1 つの配列を両方のフォールドに一致させることにより、A フォールドと B フォールドの両方に存在する配列を作成しました 29,52。 53. ここでのアプローチは概念的に似ていますが、ファージディスプレイではなく互換性のある突然変異をテストするための計算設計ツールとして Rosetta54 を使用する点が異なります。設計プロセスは次のとおりです。

A または B シーケンスを SI 折りタイプと S'I 折りタイプの両方に通します。

壊滅的な相互作用の数を最小限に抑える調整を特定します。

Pymol55 を使用して 4 ～ 6 アミノ酸のクラスター内の好ましくない相互作用を解決する変異を設計し、Rosetta-Relax54 を使用してエネルギーを最小化します。

重複しない位置でアミノ酸を計算的に変異させることにより、S フォールドでのタンパク質の安定性を最適化します。 Rosetta-Relax でエネルギーの最小化と評価を繰り返します。

計算設計に伴う不確実性を軽減するには、可能な限り元のアミノ酸を保存してください。

この方法が最適であると考える理由はありません。私たちは、2 組のネイティブ相互作用と互換性のある配列を操作し、構造、安定性、機能を評価するための実用的なスキームを適用しているところです。初期設計は、以下に説明するように、NMR による構造分析、アンフォールディングの熱力学分析、および結合アッセイを使用した機能分析に基づいて洗練されました。「方法」セクションで説明したように、設計されたすべてのタンパク質を大腸菌で発現させ、均一になるまで精製しました。

56 アミノ酸の HSA 結合 A フォールドと 99 アミノ酸の SI フォールドのアラインメント、およびその後の壊滅的な相互作用を解決する突然変異により、Sa1 および A1 と呼ばれる低エネルギースイッチ候補が生成されました。 A1の正確な配列は、α1ヘリックスが構造的に整列するように、Sa1の11〜66位に埋め込まれています（図3a、補足図2A）。最終的な計算モデルは、Relax アプリケーションを使用して Rosetta によって生成されました。 Relax プロトコルは、実験的に決定された構造の周囲の局所的な立体構造空間を検索し、設計された変異がその限られた立体構造空間内で好ましいネイティブ相互作用を持つかどうかを評価するためにのみ使用されます。 Sa1 と A1 の設計モデルは、それぞれの緩和されたネイティブ構造と比較して、エネルギーが非常に似ています (補足図 3 およびソースデータファイル)。

a A1 と Sa1 の配列アラインメント。これらは 56 アミノ酸の A 領域にわたって 100% 同一です。 b Sa1 (黒) および A1 (赤) の 2 次元 1H-15N HSQC スペクトルと主鎖アミドの割り当てを重ね合わせた図。スペクトルはそれぞれ 25 °C と 5 °C で記録されました。 c A1 の 10 個の最低エネルギー CS ロゼッタ構造のアンサンブル (左パネル)。 A1 構造 (緑色) と親 GA フォールド (オレンジ) の重ね合わせ (右パネル)。 d Sa1 の 10 個の最低エネルギー CS ロゼッタ構造のアンサンブル (左パネル)。 Sa1 (緑) と親 S6 フォールド (オレンジ) の重ね合わせ (右パネル)。 e 設計されたタンパク質のバックボーンダイナミクス。 600 MHz での {1H}-15N 定常状態の異核 NOE 値と A1 (赤) および Sa1 (黒) の残基のプロット。異核 NOE の各セットは 1 回の実験から得られました。誤差は、測定されたバックグラウンドノイズレベルに基づいて推定されました。

全体として、A1 の 3α ヘリックスバンドルトポロジーは、その由来となった GA 親構造と非常によく似ています 56。 A1 の配列固有の化学シフト割り当て (図 3b) を利用して、CS-Rosetta を使用して 3D 構造を計算しました (図 3c、表 1)。我々の以前の研究では、CS-Rosetta と A フォールドと B フォールドの de novo 構造が高い配列同一性で密接に一致していることが示されました 57。 N末端残基1〜4とC末端残基53〜56は構造が乱れており、{1H}-15N定常状態の異核NOEデータと一致しています（図3e）。同様に、Sa1 は親 S6 構造と同じ全体的な βαββαβ トポロジーを持ちます (図 3d、表 2)。主鎖の化学シフト（図3b）を主鎖プロトン間NOE（補足図4）と組み合わせて使用し、CS-Rosetta（PDB 7MN1）を利用して三次元構造を決定しました。立体構造アンサンブルは、残基 2 ～ 10 (β1)、16 ～ 32 (α1)、40 ～ 44 (β2)、59 ～ 67 (β3)、73 ～ 81 (α2)、および 86 に明確に定義された二次構造要素を示しています。 –92 (β4)。天然構造との主な違いは、β2 鎖が S6 よりも Sa1 の方が 7 アミノ酸短いことです。異核NOEデータは構造との全体的な一致を示し、残基45〜58のβ2鎖とβ3鎖の間の長いループがポリペプチド鎖の他の内部領域よりも柔軟であることを示しています（図3e）。

A1 の 56 アミノ酸配列は Sa1 の残基 11 ～ 66 と 100% 同一ですが、主鎖のかなりの部分が 2 つの構造間で変化します。最も注目すべきことは、A1とSa1の両方のα1ヘリックスの長さは同様ですが、A1のα2およびα3ヘリックスに対応する領域がSa1のβ2およびβ3鎖を形成していることです（図4a）。 A1 の α1 ヘリックスのコアアミノ酸は、Sa1 のコアにも寄与する残基に対応します。しかし、Sa1のα1ヘリックスは、ほぼ完全に異なる残基のセットと接触しています（図4b）。たとえば、A1 の C 末端テールにあるアミノ酸 L51、Y53、および I55 は、α1 と広範な接触を持っていませんが、Sa1 の対応する残基 (L61、Y63、および I65) は、α1 との密接なコア相互作用を形成します。 β3ストランド。 Sa1 の α1 ヘリックスに接触する他のコア残基のほとんどは、A1 フォールドをコードする 56 アミノ酸領域の外側にあります。これらには、β1 鎖の F4、V6、I8、および L10 が含まれます。 β3鎖のA67。 α2ヘリックスからのV72、L75、およびL79。 α2ヘリックスとβ4ストランドの間のループからのV85。 2 つの追加残基、V88 および V90 (β4) もコアに大きく寄与しますが、α1 には接触しません。したがって、α1-ヘリックスの元のトポロジー的配置を除いて、3αおよびα/β-ひだのコアはほとんど重なりません。合計すると、Sa1 コアに関与する残基の約半分が A1 配列に存在しません。

a メインチェーンの比較。 (左のパネル) 二次構造要素を色分けした A1 の CS ロゼッタ構造。 (右パネル) Sa1 の CS-Rosetta 構造上にマッピングされた、対応する色分けされた領域。バックボーン構造の変化を示しています。コムギでは、A1 の 56 アミノ酸配列以外の領域が示されています。 b 側鎖の比較。 (左パネル) α1-ヘリックスからの A1 のコアに寄与する残基 (黄色) および他の領域からの残基 (シアン)。 Sa1 の非α1 コア残基 (ピンク) は、A1 コアと重複しません (詳細については本文を参照)。 (右パネル) α1 ヘリックスから Sa1 のコアに寄与する残基 (黄色)、および他の関与するコア残基の大部分 (ピンク)。 A1 の非α1 コア残基も示されており (シアン)、重複度が低いことが強調されています。

遠紫外 CD スペクトルは Sa1 と A1 について測定され、それらの熱アンフォールディングプロファイルは、温度に対する 222 nm での楕円率を測定することによって決定されました (図 5 および補足図 5)。 Sa1 の TM は約 100 °C で、25 °C での推定ΔGfolding は -5.3 kcal/mol です（図 5b、補足表 1）58。親 S6 の ΔGfolding は、-8.5 kcal/mol40 です。 Sa1 デザインのロゼッタエネルギーは、ネイティブシーケンスのロゼッタエネルギーと類似しています (補足図 3)。 A1 の TM は 65 °C、25 °C での ΔGfolding = −4.0 kcal/mol です 58 (図 5a、補足表 1)。親 GA の ΔGfolding は、-5.6 kcal/mol59,60 です。 A1 デザインのロゼッタエネルギーは、ネイティブシーケンスよりもわずかに有利です (補足図 3)。

a A および B 変動の 222 nm での楕円率対温度のプロット。 b S 変化の 222 nm での楕円率と温度のプロット。 Sb0 は、折り畳まれていない状態の温度依存性を測定するために使用される Sb1 の低安定性バリアント (F7V) です。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

フォールドスイッチの初期設計は、機能の保持を考慮せずに実行されました。その結果、結合界面の 2 つのアミノ酸が変異しているため、A1 は検出可能な HSA 結合親和性を持ちません。しかしながら、表面変異E28YおよびK29YがA1(A2と表記)に生じた場合には、顕著なHSA結合が回復する。これらの変異は A1 の構造に影響を与えないようですが (補足図 5)、KD ≤ 1 μM の HSA 結合をもたらします (補足表 1)。これは、「方法」セクションに記載されているように、固定化されたHSAへの結合を測定することによって決定されました。

Sa1 は、その設計において C 末端アミノ酸が保存されていないため、プロテアーゼに結合しません。ただし、その 3 つの C 末端アミノ酸 (AAD) を DKLYRAL (Sa1I と表記) に置き換えることによって、プロテアーゼ阻害剤に変換できます。 E38Y、K39Y 変異を作成することにより、正確な 56 アミノ酸 A2 配列を含むバージョンの Sa1I も作成されました (Sa2I と表示)。 CD分析によると、Sa1、Sa1I、およびSa2Iは構造が類似しています（補足図5）。「方法」セクションに記載されているように、操作されたズブチリシンによる Sa2I の阻害定数は 50 nM と決定されました (補足表 1)。したがって、HSA結合機能を有する安定なAフォールドは、プロテアーゼ阻害剤機能を有する99アミノ酸のSフォールド内に埋め込むことができる(図2c、e)。すべての HSA 接触アミノ酸は A2 配列と Sa2I 配列の両方で保存されていますが、HSA 接触表面の形成に必要な三次元トポロジーは A-fold50 でのみ発生することに注意してください。それにもかかわらず、Sa2I は HSA に弱く結合することが観察されました (KD ～ 100 μM、補足表 1)。この弱い親和性は、α/β-ひだフォールドが強く優勢であるにもかかわらず、一部の Sa2I 分子が 3α フォールドに存在する可能性があることを示唆しています。

S から B へのフォールドスイッチの設計では、2 つのトポロジーアライメントを使用しました。 1つ目はSIフォールドとBフォールドの間にあり、各フォールドのβ1鎖が整列していました（補足図2Bおよび6A）。 2番目のアラインメントはS'IフォールドとBフォールドの間であり、SIのβ2とβ3の間の長いループが天然のプロテアーゼ阻害剤とより一致するようにS'Iで短縮された。このスキームでは、Bフォールドのα1β3β4トポロジーがS'Iフォールドのα1β2β3トポロジーと整列しました（図6a、補足図2C）。

a 56 アミノ酸の B 領域にわたって 1 残基 (L5Y) が異なる、B4 と Sb3 の配列アラインメント。 b Sb3 (黒) および B4 (赤) の二次元 1H-15N HSQC スペクトルと主鎖アミドの割り当てを重ねたもの。スペクトルは 25 °C で記録されました。 A56 ピークはエイリアス信号です。アスタリスクで標識されたピークは、B4 濃度が低下するにつれて相対強度が減少し、単量体に加えて弱く結合した推定上の二量体の存在を示しています。 c B4 の 10 個の最低エネルギー CS-Rosetta 構造のアンサンブル (左パネル)。 B4 構造 (緑色) と親 GB 折り目 (オレンジ) の重ね合わせ (右パネル)。 d Sb3 の 10 個の最低エネルギー CS ロゼッタ構造のアンサンブル (左パネル)。 Sb3 (緑色) と親 S6 フォールド (オレンジ) の重ね合わせ (右パネル)。 e 600 MHzでの{1H}-15Nの定常状態の異核NOE値とB4（赤）およびSb3（黒）の残基のプロット。異核 NOE の各セットは 1 回の実験から得られました。誤差は、測定されたバックグラウンドノイズレベルに基づいて推定されました。

最初のアプローチでは、B フォールドと S フォールドの β1 鎖のアライメントとそれに続く壊滅的な相互作用を解決する突然変異によって、B1 および Sb1 と呼ばれる低エネルギーのスイッチ候補が生成されました。 B1 の正確な配列は、Sb1 の 4 ～ 59 位に埋め込まれています（補足図 6A）。 B1 と Sb1 の計算モデルは、対応する緩和されたネイティブ構造と比較して、エネルギーの比較的小さな増加を示します (補足図 3)。 B1のNMR構造は、親Bフォールドと同一のββαββトポロジーを示し、主鎖RMSDは約0.6Åでした（補足図6B、C）。ただし、Sb1のトポロジーは親S6構造と同じではなく、B1のトポロジーと同様の折り畳みを持っています（補足図6B、D、および7、PDB 7MQ4）。 Sb1に13の変異を導入すると、Sb2と呼ばれるタンパク質が生成されました（補足図8）。 Sb2には4つのβストランドと2つのαヘリックスが含まれており、親のSフォールドの一般的な特徴を備えています（補足図9、PDB 7MN2）。ただし、Sb2の56アミノ酸バージョン（B2と表記）はB1よりも大幅に高いロゼッタエネルギーを有しており、おそらく展開されています（補足図3）。したがって、B1/Sb1 タンパク質ペアも B2/Sb2 タンパク質ペアも、異なるフォールドを持つ高い同一性配列をもたらしませんでした。それにもかかわらず、B1は、Sフォールドタンパク質Sb2の対応する埋め込み領域と80％同一です（補足図9A）。 B1、Sb1、および Sb2 の構造については、補足および表 1 および表 2 に詳しく説明されています。

S-to-Bスイッチの設計を改善するために、BフォールドをS'阻害剤フォールドと整列させ、Bのα1β3β4とS'のα1β2β3の間のトポロジー的一致を生み出すアラインメントを選択しました（補足図2C）。このアライメントにおける有害な相互作用を解決するための変異により、B3およびSb3で示される低エネルギースイッチ候補が生成されました（補足図10）。 B3 の正確な配列は、Sb3 の 1 ～ 56 の位置に埋め込まれています。 Sb3 の計算モデルのエネルギーは、緩和されたネイティブ構造よりわずかに有利です。 B3 の設計モデルは、緩和されたネイティブ構造と比較してエネルギーの比較的小さな増加を示します (補足図 3)。

NMRに基づく構造決定により、Sb3がβαββαβ二次構造およびS折りトポロジーを有することが示されました（図6a、b、d、PDB 7MP7）。順序付けられた領域は、残基 4 ～ 10 (β1)、24 ～ 37 (α1)、42 ～ 46 (β2)、51 ～ 56 (β3)、62 ～ 70 (α2)、および 79 ～ 85 (β4) に対応します。 Sb3 を親 S フォールドと比較すると、フォールドの β1/α2/β4 部分が両方で類似していることが示されます。対照的に、β1-α1 ループは親 S フォールド (5 残基) よりも Sb3 (13 残基) で長く、α1、β2、β2-β3 ループ、および β3 はすべて親よりも短くなります (図.6d）。 Sb3構造と一致して、13アミノ酸のβ1-α1ループは非常に柔軟性があります（図6e）。我々はまた、埋め込まれたBフォールド、Sb3の56アミノ酸バージョン（B3と表記）に対応する切断型タンパク質を発現および精製した。 5℃および低濃度（<20μM）でのB3の2D 1H-15N HSQCスペクトルは、主な単量体Bフォールドと一致していました（補足図11）が、25℃では顕著な交換ブロードニングを示し、低濃度であることを示しています。安定性（以下を参照）。おそらく、安定性が低いのは、より小さな脂肪族ロイシンと比較して、B フォールドのコアにおける Y5 の充填があまり好ましくないためであると考えられます。しかし、タンパク質濃度の増加とともに相対ピーク強度が増加する、推定上のオリゴマー種もさらに存在しました。 B3 は安定性が比較的低く、サンプルが不均一であるため、これ以上の構造分析は行われませんでした。

我々は、Sb3のNMR構造を使用して、Sフォールドのネイティブな接触を損なうことなく、埋め込まれたBフォールドを安定化させる点突然変異、チロシン5からロイシン（Y5L）を設計しました（補足図10）。したがって、この変異体は集団を B フォールドにシフトすると予想されました。２つの突然変異体、すなわちＳｂ３のＹ５Ｌ突然変異体（Ｓｂ４と示す）およびＢ３のＹ５Ｌ突然変異体（Ｂ４と示す）を調製した。 B4 は確かに B3 よりも安定しています (図 5a、補足表 1)。 B4の割り当てと構造決定により、そのトポロジーが親Bフォールドと同一であることが示されました（図6b、c）。 100 μM を超える濃度では、B4 は B3 で見られたのと同様に弱い自己会合の傾向を示しました。 Sb4の場合、HSQCスペクトルはSb3と比較して約2倍の数のアミドクロスピークを示し（図7a）、S状態とB状態が同時に存在することを示唆しています。これは、NMR 帰属と、Sb4、B4、および Sb3 の HSQC スペクトルの比較によって確認されました。 Sb4骨格アミドシグナルのかなりの部分（約50ピーク）はB4のシグナルとほぼ一致しており、B状態の存在を示しています（補足図12A〜C）。これらのピークが厳密に一致するのは、おそらく Sb4 の B 状態の残基 1 ～ 56 が B4 と配列的に同一であるためと考えられます。 Sb4 の B 状態と B4 の間の最大のアミドシフト摂動は、G41 などの B フォールドの C 末端に近い残基で発生します。Sb4 には追加の残基があり、B4 には追加の残基がありません。 Sb4 シグナルの多くは Sb3 ともよく一致しましたが、類似度は B4 ほど広範囲ではありませんでした (補足図 12D–F)。 Sb4 と Sb3 の S 状態間のアミド化学シフトのより顕著な違いは、コアに隣接して位置する比較的大きな変化である Y5L 変異による可能性があります。これらのあいまいさを解決するために、Sb4 の S 状態に対してバックボーン共鳴の割り当てが行われました (図 7a、[https://doi.org/10.13018/BMR51719] 詳細については「方法」セクションを参照)。 Sb4 の S 状態割り当てと Sb3 との比較により、より大きなアミドシフト摂動のほとんどが β1 鎖と β4 鎖にあることが示されました。二次シフト解析により、Sb4のS状態の二次構造要素のパターンがSb3のパターンと類似していることが示されました（図7b）。プロトン間 NOE 分析により、β ストランドの配置も同様であることが示されました (図 7c)。まとめると、これらの結果は、Sb4 が 25 °C で S フォールドと B フォールドの両方にほぼ均等に存在することを示しています。さらに、ZZ交換スペクトルは、Sb4のS状態とB状態がNMRタイムスケールでゆっくりと立体構造交換していることを実証しました（図7d）。

a 25 °C での Sb4 (左)、B4 (中央)、および Sb3 (右) の 2 次元 1H-15N HSQC スペクトル。 Sb4 スペクトルでは、S 状態 (青) と B 状態 (赤) の主鎖アミド共鳴の割り当てが示されています。 b TALOS-N を使用した化学シフトからの、30 °C での Sb4 の S 状態（赤色）と 25 °C での Sb3 の S 状態（灰色）の規則的二次構造領域の信頼レベル。三次元構造から決定された Sb3 の二次構造要素がプロットの上に示されています。 c 25℃でのSb3（黒）と30℃でのSb4のS状態（赤）の3D 15N-NOESYデータからの長距離バックボーンNOEの概要。 d 25 °C での Sb4 の 300 ms ZZ 交換スペクトルの Gly41 領域。S 状態と B 状態の間の交換ピークを示します。

最後に、埋め込まれた B フォールドの配列を変更せずに S フォールドを不安定化するために、Sb4 のロイシン 67 からアルギニン (L67R) への変異を設計しました。変異体はSb5として示されます（補足図10）。これにより、人口がB層にシフトすると予想されました。 Sb5 の 2D 1H-15N HSQC スペクトルは、L67R 変異が実際に S フォールドを不安定化し、S 型アミドのクロスピークの喪失と、B-型への切り替えを示す新しい一連のシグナルの同時出現を示していることを示しています。折り畳み。 Sb5のスペクトルとB4のスペクトルを重ね合わせると、Sb5の新しい信号がB4のスペクトルとほぼ一致していることがわかります（補足図13）。したがって、L67R 変異は平衡を S フォールドから B フォールドにシフトします。 B4 では検出されない、HSQC スペクトルの中央領域にある追加のシグナル (約 25 ～ 30) は、おそらく Sb5 の C 末端テールの乱れによるものと考えられます。 B4と比較してSb5のB領域における化学シフトまたはピーク強度の変化がほとんどないことからわかるように、Sb5のC末端尾部はBフォールドと広範囲に相互作用しているようには見えない。

Sb3 と B4 の整列したアミノ酸 1 ～ 56 は 98% の配列同一性を持ち、唯一の違いは Sb3 の L5Y 変異です (図 6a)。ただし、Sb3とB4の全体的な折り目には大規模な違いがあります（図8a、補足図4）。 β1 鎖は長さは同様ですが、Sb3 と B4 では反対方向になっています。 β1 鎖は、B4 では β4 と平行鎖相互作用を形成しますが、Sb3 では対応する β3 鎖と逆平行相互作用を形成します。残基9〜20はB4の6残基β1-β2ターンと6残基β2鎖を形成するが、これらの同じアミノ酸はβ1の末端とSb3の大きく無秩序なβ1-α1ループの10残基を構成する。 B 領域の残りの部分はトポロジー的に類似しており、B4 の α1/β3/β4 構造は Sb3 の α1/β2/β3 構造と一致します。しかしながら、全体としては、4本鎖βシートにおける水素結合の順序は全く異なっており、Sb3ではβ2β3β1β4、B4ではβ3β4β1β2となっている。

a メインチェーンの比較。 (左パネル) 二次構造要素が色分けされた B4 の CS-Rosetta 構造。 (右パネル) Sb3 の CS-Rosetta 構造上にマッピングされた対応する色分けされた領域。バックボーン構造の変化を示しています。 B4 の 56 アミノ酸配列の外側の領域が小麦で示されています。 b 側鎖の比較。 (左パネル) α1/β3/β4 (黄色) および他の領域 (シアン) からの B4 のコアに寄与する残基。 Sb3 の非α1/β2/β3 コア残基 (ピンク) は、B4 コアと重複しません (詳細については本文を参照)。 (右パネル) α1/β2/β3 から Sb3 のコアに寄与する残基 (黄色)、およびその他の関与するコア残基 (ピンク)。 B4 の非α1/β2/β3 コア残基も示されています (シアン)。B4 と Sb3 の間の単一の L5Y アミノ酸の違いが強調表示されています。

B4の主なコア残基は、β1のY3、L5、L7、およびL9、α1のA26、F30、およびA34、およびβ4のF52およびV54で構成されます（図8b）。 Sb3 では、コアのトポロジー的に等価な領域は、α1 の A26、F30、および A34、β3 の F52 および V54 です。 Sb3 の β1 鎖の残基 Y5、L7、および L9 もコアの一部を形成しますが、β1 の配向が逆であるため、B4 とはパッキングが異なります。 B4 のコアの周辺に寄与する残基 A12 および A20 は、Sb3 の β1-α1 ループで溶媒にアクセス可能です。 Sb3 の残りのコア残基のほとんどは B 領域の外側に由来し、β3 (A56)、α2 (V64、L67、A68、L71)、および β4 (V80 および I82) のアミノ酸が含まれます。

遠紫外 CD スペクトルは B3、B4、Sb3、Sb4、および Sb5 について測定され、それらの熱アンフォールディングプロファイルは、温度に対する 222 nm での楕円率を測定することによって決定されました (図 5、補足図 10、補足表 1)。上述したように、Sb3 の主な形態は S フォールドです。 CD および NMR 分析は、B3 が主に B フォールドであり、25 °C での ΔG フォールディングが -1.2 kcal/mol であることを示しています58。 NMR 分析から、B フォールドは推定上の二量体状態と平衡状態にあるようです。これにより、B フォールドが温度と濃度の両方に依存する状況が生じます。ただし、5 °C、≤18 µM での主な形態は B フォールドです。 B3 の低い安定性と濃度依存性の挙動は、S 型立体配座の傾向が 56 残基のタンパク質内に存続している可能性があることを示している可能性があります。

Sb4 では 25 °C で S- と B- の両方がほぼ均等に存在していますが (図 7)、Sb4 は Sb3 と非常によく似た温度展開プロファイルを持っています (図 5)。これは、Y5L 変異により、ほぼ等エネルギー的であり、折り畳まれていない状態と比較して熱力学的に安定した 2 つの折り畳みが生じることを示しています。さらに、S フォールドと B フォールドは平衡状態にあり、ほぼ均等に存在しているため、S フォールドから B フォールドへの切り替えの自由エネルギー (ΔGB フォールド/S フォールド) は 25 ℃で約 0 kcal/mol になります。 ℃。スイッチ平衡は、Sb4 の S フォールド集団に対する拮抗的な B フォールドの影響を反映しており、残基 5 のロイシンは S 状態を犠牲にして代替 B 状態の安定化に役立ちます。 CD による熱変性は、B4 が 25 °C で ΔGfolding = −4.1 kcal/mol であることを示しています58。 Sb5の熱変性プロファイルは、中点〜10℃の低温転移と中点〜60℃の主要転移を示します（図5b）。 NMR 分析は、主要な遷移が B フォールドの展開であることを示しています。したがって、Sb5 の 67 位のアルギニンは S フォールドを不利にすることで B フォールドをより有利にし、NMR によって観察された混合から B フォールドへの集団の変化と一致します。

Sb3 タンパク質は S'I と密接に関連していますが、スイッチの設計において C 末端アミノ酸が変更されているため、阻害剤機能が欠けています。ただし、C 末端アミノ酸の VTE を DKLYRAL に変更することで、プロテアーゼ阻害剤に変換できます。この変異体は Sb3I と呼ばれます。 CD分析によると、Sb3とSb3Iは構造が類似しているように見えます（補足図10）。操作されたズブチリシンによる Sb3I の KI は 50 nM と決定されました (補足表 1)。

IgG への結合は、B3 および Sb3I について測定されました (補足表 1)。 B3 および Sb3I は、それぞれ KD ≤ 1 μM および 10 μM で IgG セファロースに結合しました。おそらく、Sb3Iは、Bフォールドのα1β3 IgG結合表面の大部分がSフォールド内に保存されているため、顕著なIgG結合活性を有すると考えられる。したがって、Sb3Iは、IgG結合機能とプロテアーゼ阻害剤機能の両方を備えた二重機能タンパク質です（図2f）。

S、A、B フォールド間で交差する経路のネットワーク全体を図 9 にまとめます。経路上の最初のノードは、フォールドスイッチを持たない RNA 結合タンパク質からプロテアーゼ阻害剤への機能スイッチです。 α/β ひだは一般的な折り畳みであり、この基本的なトポロジーを持つタンパク質には多くの異なる機能が含まれています 42。 SI ノードと S'I ノードを操作すると、いくつかの突然変異を伴う α/β ひだトポロジーでプロテアーゼ阻害剤の機能がどのように発生するかを示します。 S6タンパク質のC末端アミノ酸のみを置換すると、プロテアーゼの基質結合溝との相互作用が生じます（図2a、b）。この C 末端相互作用に加え、α/β プレイトの β シート表面とプロテアーゼの 2 つの α ヘリックスとの間の偶発的接触により、50 nM 範囲でプロテアーゼ阻害が生じます。 30S 複合体中の S6 の構造に基づくと、C 末端修飾はリボソーム RNA および S15 タンパク質との結合相互作用に大きな影響を及ぼさない可能性があります (図 2a)43。したがって、RNA 結合タンパク質からプロテアーゼ阻害剤への移行はおそらく中断されません。 SI 阻害剤の β1-α1 ループの挿入と β2-β3 ループの欠失により、天然のプロドメイン型阻害剤によりよく似たトポロジーが形成され 44,46,61、S' フォールドに同様の α1β2β3 モチーフが形成されます。 Bフォールドのα1β3β4モチーフに。このトポロジカルな類似性により、S'I が B フォールドとの交差に近づきます。したがって、SI ノードと S'I ノードは両方とも、S フォールドをそれぞれ A フォールドと B フォールドに切り替えるための機能スイッチおよび分岐点です。

安定なフォールド間の切り替えは、単一のアミノ酸の突然変異、または S フォールドを安定化する末端配列の欠失/付加によって誘導できます。青は S 折り、緑は B 折り、赤は A 折りを示します。灰色の矢印は、フォールドスイッチを使用せずに再設計されたタンパク質を接続します。 Sb4 は 2 つのフォールドを同時に観察します。 GA98 および GB98 構造は、それぞれ PDB コード 2LHC および 2LHD (参考文献 32) からのものです。

フォールド交差部でノードを操作するには、2 つの異なるフォールドにおけるネイティブ相互作用と互換性のある配列を設計する必要がありました。これを行うために単純なルールを使用しました。最初のルールは、配列の類似性を最大化するのではなく、トポロジーを調整することでした。共通のトポロジを特定すると、矛盾する衝突が少ないレジスタを特定するのに役立ちます。例えば、SIフォールドのα1ヘリックスとAフォールドのα1ヘリックスのトポロジー的整列は、SIフォールドのα1に隣接する領域が2つの異なるフォールドモチーフをコードできるため、フォールドスイッチの操作を容易にする。 S 折りや B 折りの場合のように、トポロジーの整列が不十分な場合は、より良い整列を作成するために、長い方の折り目の曲がりの自然な変化を探すことが役立ちました。より大きな折り目でのループとターンのバリエーションにより、設計の自由度が高まり、スイッチの確率が高くなります。アライメントを選択したら、壊滅的な衝突を解決するための基本的なルールは、可能な限り元のアミノ酸を保存することです。これにより、コンピューテーショナルデザインに伴う不確実性が軽減されます。ロゼッタエネルギー関数は、好ましいアライメントを予測するためには使用されませんでしたが、アライメントが選択された後に衝突を解決するために突然変異を評価する際には重要でした。

2 セットのネイティブ相互作用と互換性のある突然変異を選択するには、個々のフォールドのネイティブ状態のエネルギー学におけるトレードオフが必要でした 5,11。ノードは、両方の交互の折り目が展開された状態に対して安定している場合に生成される可能性があります。折り畳まれていない状態（つまり、二次構造がほとんどない状態）に対する安定性は、CD 融解によって決定されました（図 5）。推定上のノード配列の短い (56 残基) と長い形態の両方の安定性を調べることは有益でした。 G フォールドの独立した安定性は、長い配列に存在する S フォールドからの拮抗作用なしに、短い形式で決定できます。 A1 および A2 タンパク質の安定性は、25 °C で約 -4 kcal/mol 58 であるのに対し、天然の GA タンパク質の安定性は -5.6 kcal/mol 56 です。 B3 と B4 の安定性は、25 °C でそれぞれ -1.2 kcal/mol と -4.1 kcal/mol 58 であるのに対し、天然 GB タンパク質の安定性は -6.7 kcal/mol 62 です。より長い配列の場合、Sa1 と Sb3 の ΔGfolding は、25 °C でそれぞれ -5.3 kcal/mol と -3.5 kcal/mol 58 であるのに対し、天然 S6 タンパク質の -8.5 kcal/mol 40 と比較して、58 です。

ただし、S フォールドの場合、安定した埋め込まれた G フォールドのエネルギー効果も考慮する必要があります。両方の折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の間の平衡は熱力学的に関連しているため、S 折りから G 折りへの切り替えの自由エネルギー (ΔGG 折り/S 折り) は、ΔG 折りの差 (ノードタンパク質の短い形態と長い形態の間のΔΔGfolding)。たとえば、A1 および Sa1 の ΔG 倍に基づいて、Sa1 の予測Δ GA 倍/S 倍は 1.3 kcal/mol です。これは、ＮＭＲによって決定された主要なＳフォールドの構造と一致するが、弱いＨＳＡ結合によって示唆される３αフォールドの小さな集団とも一致する。 B3 および Sb3 の熱変性プロファイルから、Sb3 の予測ΔGB 倍/S 倍は 2.3 kcal/mol であり、この値は NMR 実験で観察された安定な S 倍と一致します。しかし、Sb3 配列も臨界点に近づきつつあります。 B フォールド (Y5L) を安定化する Sb3 の置換により、Sb4 の平衡が B フォールドと S フォールドのほぼ等しい混合物にシフトします。つまり、Sb4 の ΔGB 倍/S 倍は、25 °C で約 0 kcal/mol です。 Sフォールド（L67R）を不安定化するさらなる置換により、Sb5の集団が安定なBフォールド（ΔGBフォールド/Sフォールド≤ -5 kcal/mol）にシフトします（図9）。

折り目の間にノードが存在することは、新しい機能の進化に影響を与えます。 S/A ノードの場合、HSA のすべての接触アミノ酸は、わかりにくいトポロジーではあるものの、プロテアーゼ阻害剤 Sa2I の S フォールド内に存在します。アミノ酸 67 ～ 99 (A2) を欠失させると、阻害剤機能が失われ、α/β ひだから 3α へのフォールドスイッチが発生します。 HSA結合活性（KD < 1μM）の獲得は、フォールドスイッチを介した隠れたHSA結合アミノ酸のマスク解除から生じます（図2e）。血清中の HSA 濃度は >500 µM であるため、このレベルの結合親和性は生物学的に関連している可能性があります63。 S/B ノードの場合、α1β3 モチーフにはすべての IgG 接触アミノ酸が含まれており、Sb3I は IgG (KD = 10 μM) とプロテアーゼ (KI = 50 nM) の両方に対してある程度の親和性を持っています。この場合、Y5L変異（Sb4）または57-91の欠失（B4）により、α/βプレイトからβ-グリップへのフォールドスイッチが引き起こされ、より緊密なIgG結合が生じます（KD≤1μM）（図2f））。血清中の IgG 濃度は >50 μM (または >100 μM Fc 結合部位) であるため、このレベルの結合親和性は生物学的に関連している可能性もあります 64。我々は以前、HSA結合機能を持つAフォールドが、フォールドを切り替えて2つのリガンドの潜在的な接触アミノ酸を明らかにする単一アミノ酸置換を介して、IgG結合機能を持つBフォールドに切り替えることができることを示した29,32。

結論として、2 つのフォールド間に重要なポイントを形成する高アイデンティティノードのネットワーク内の 3 つの共通フォールドを接続することが可能でした。他の複雑なシステムと同様に、臨界点近くのタンパク質の小さな変化は、フォールドの配置方法に「バタフライ効果」をもたらす可能性があります。タンパク質の折り畳みコードのこの特性は、複数の折り畳みと機能を備えたタンパク質が高度に同一なアミノ酸配列で存在できることを意味します。これは、新しいひだや機能の進化が、途切れることのない突然変異経路をたどることがあることを示唆しています。

突然変異誘発は、Q5® 部位特異的突然変異誘発キット (NEB) を使用して実行されました。 GA および GB バリアントは、次の配列をコードするベクター (pH0720) にクローン化されました。

MEAVDANSLA QAKEAIKEL KQYGIGDKYI KLINNAKTVE GVESLKNEIL KALPTEGSGN TIRVIVSVDK AKFNPHEVLG IGGHIVYQFK LIPAVVVDVP ANAVGKLKKM PGVEKVEFDH QYRGL

N末端融合ドメインとして56。細胞増殖は自動誘導によって行われました 29,65。細胞を 3750 × g で 20 分間遠心分離して回収し、0.1 M KPi、pH 7.2 中で氷上で超音波処理して溶解しました。細胞破片を 10,000 × g で 15 分間遠心分離してペレット化しました。上清を 45,000 × g で 30 分間遠心分離して清澄化しました。タンパク質は、スイッチタンパク質の精製に以前に使用された第 2 世代のアフィニティー切断タグシステムを使用して精製されました 29,66。第 2 世代のタグは、スイッチタンパク質の高レベルの可溶性発現をもたらし、また、C 末端 EFDHQYRGL 配列を介して固定化されたプロセシングプロテアーゼにしっかりと結合することにより、融合タンパク質の捕捉を可能にします。ローディングおよび洗浄は、20 mM KPi、pH 6.8のランニングバッファーを使用して、5 mL Im-Prot カラムに対して5 mL/分で行われました。高純度に必要な洗浄量は、標的タンパク質の粘着性とそのタンパク質がカラムにどれだけ結合しているかによって異なります。通常、10 カラム容量 (CV) の洗浄溶液で洗浄し、続いて 3 CV の 0.5 M NaCl、次に約 10 CV のランニングバッファーで洗浄します。必要に応じてこれを繰り返すことができます。 0.5 M NaCl ショットは、各高塩分ショットで放出される吸光度が小さくなり、一定になるまで繰り返されます。切断を開始する前に、すべての高塩溶液が洗い流されます。 15 mL のイミダゾール溶液 (0.1 mM) を 1 mL/分、22 °C で注入することにより、標的タンパク質を Im-Prot カラムから切断しました。切断されたタンパク質は通常、2 ～ 3 CV で鋭いピークとして溶出します。精製されたタンパク質は、NMR 分析の必要に応じて 0.2 ～ 0.3 mM に濃縮されました。 15 mL の 0.1 N H3PO4 (100 mL あたり 0.227 mL 濃リン酸 (85%)) を約 1 CV/分の流速で注入することによってカラムを再生しました。洗浄溶液はストリッピング直後に中和された。精製システムは、Potomac Affinity Proteins から入手できます。

プロテアーゼ阻害剤タンパク質は、Im-Prot 培地に結合させ、次に精製した阻害剤を 0.1 N H3PO4 で除去することによって精製しました。次いで、1/10 容量の 1 M K2HPO4 を加えてサンプルを直ちに中和しました。

設計されたすべての構造のロゼッタエネルギーは、Slow Relax ルーチンを使用して生成されました54。各設計に対して 1000 個のデコイが計算されました。各設計の最低エネルギーデコイの PDB 座標とエネルギーパラメーターが補足ファイルとして含まれています。

CD測定は、ペルチェ温度コントローラーを備えたJasco分光偏光計モデルJ-1100を用いて、100mM KPi、pH 7.2中で実施した。タンパク質濃度が 3 μM および 30 μM の場合は、光路長が 0.1 cm および 1 cm の石英セルをそれぞれ使用しました。楕円率の結果は、平均残余楕円率 [θ]、deg cm2 dmol−1 として表されました。 222nmでの楕円率を0.5°/分の走査速度で連続的に監視した。変性の可逆性は、融解前と、100 °C に加熱して 20 °C に冷却した後の 20 °C での CD スペクトルを比較することによって確認されました。

HSA および IgG に対するタンパク質の親和性は、固定化リガンド上でのタンパク質の保持によって決定されました。ＨＳＡおよびウサギＩｇＧは、製造業者の指示に従って、ＮＨＳ活性化セファロース４ファストフロー（Ｃｙｔｉｖａ）との反応によって固定化された。固定化されたHSAの濃度は100μMであった。固定化されたIgGの濃度は50μM(すなわち、100μMのFc結合部位)であった。一般に、試験タンパク質の 5 μM 溶液 0.2 mL を 0.5 mL/分の流速で 5 mL カラムに注入しました。結合親和性の測定では、溶出量が 100 μM の結合部位に結合した試験タンパク質の割合に比例するように結合が急速に平衡状態にあると仮定します。 20 カラム容量 (CV) 後に完全に保持されたタンパク質は、KD ≤ 1 μM であると評価されます。完全に保持されたタンパク質は、実行の最後に 0.1 N H3PO4 を使用してカラムから除去されます。

競合阻害定数 (KI) は、AnaSpec Inc. から購入した蛍光発生ペプチド基質 QEEYSAM-AMC (7-アミノ-4-メチルクマリン) と、RASProtease(I)49 として知られる高度に特異的に操作されたプロテアーゼを使用して決定されました。競合阻害定数 (KI) は、0、50、および 100 nM の各阻害剤タンパク質の存在下で KM(見かけ) を測定することによって測定されました。反応は、100 mM KPi、10 mM イミダゾール、0.005% tween-20、pH 7.0 中で 25 ℃、1 nM RASProtease(I) を用いて実行しました。 KM および KM(見かけ) を決定するために使用した QEEYSAM-AMC 濃度は、0.1、0.5、1、2、5、および 10 μM でした。初速度は、BioTek Synergy MT 蛍光マイクロプレートリーダー (Ex: 360/40、Em: 460/40) を使用して、アミド結合の加水分解による蛍光 AMC 基の放出を測定することによって決定されました。すべての反応速度実験には、高純度 (98% 以上) のプロテアーゼおよび阻害剤タンパク質が使用されました。

同位体標識サンプルは、5% D2O を含む 100 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0) 中で 0.2 ～ 0.3 mM の濃度で調製されました。 NMRスペクトルは、Z勾配1H/13C/15N三重共鳴凍結プローブを備えたBruker AVANCE III 600および900MHz分光計のTopspin3.6.1ソフトウェアを使用して収集した。標準的な二重および三重共鳴実験 (HNCACB、CBCA(CO)NH、HNCO、HN(CA)CO、および HNHA) を利用して、主鎖 NMR 帰属を決定しました。プロトン間の距離は、150 ms の混合時間で 3D 15N 編集 NOESY スペクトルおよび 3D 13C 編集 NOESY スペクトルから得られました。データ処理にはNmrPipe67を使用し、Sparky68で解析を行いました。二次元 {1H}-15N 定常状態異核 NOE 実験は、実験間に 5 秒の緩和遅延を設けて取得されました。異核 NOE の誤差は、バックグラウンドノイズレベルに基づいて推定されました。化学シフトの摂動は、Δδtotal = ((WHΔδH)2 + (WNΔδN)2)1/2 を使用して計算されました。ここで、WH は 1、WN は 0.2、ΔδH とΔδN はそれぞれ 1H と 15N の化学シフト変化を表します。 Sb1 の PRE 実験では、単一部位システイン変異サンプルを 10 当量の (1-オキシル-2,2,5,5-テトラメチルピロリン-3-メチル) メタンチオスルホネート (MTSL)、Santa Cruz Biotechnology) とともに 25 °C でインキュベートしました。 1時間反応させ、標識の完了をMALDI質量分析法で確認した。対照サンプルは、10当量のアスコルビン酸ナトリウムで還元されました。酸化状態と還元状態の主鎖アミドのピーク強度を Sparky を使用して分析しました。三次元構造は、実験的バックボーン 15N、1HN、1Hα、13Cα、13Cβ、および 13CO 化学シフト拘束を使用して CS-Rosetta3.2 で計算され、実験的バックボーン NOE パターン (A1、B1、B4、Sb1) との比較によって検証されました。追加の制約として陽子間 NOE (Sa1、Sb2) または PRE (Sb1) を直接採用しました。 1,000 個の CS ロゼッタ構造が計算され、そこからエネルギーの最も低い 10 個の構造が選択されました。 Sb3 の場合、CS-ロゼッタは独特の低エネルギートポロジーに収束できず、化学シフトと NOE パターンが S フォールドを示しているにもかかわらず、S タイプと B タイプのフォールドのほぼ均等な混合物が生成されました。この場合、CNS1.169 を使用して、TALOS-N70 を使用した化学シフトデータからのバックボーン二面体拘束を含む構造 56 を決定しました。 Sb4 の S 状態のバックボーン共鳴は、S 状態がより有利に存在する条件下 (30 °C、100 mM KPi、200 mM 塩化ナトリウム、pH 7.0) で、上記の三重共鳴法を使用して割り当てられました。次に、アミドの帰属を、100 mM KPi、pH 7.0中、25℃でSb4の二次元1H-15N HSQCスペクトルに移しました。 Sb4 の S 状態のプロトン間 NOE は、150 ms の混合時間で 3D 15N 編集された NOESY スペクトルを使用して、30 °C/高塩条件で得られました。二次元 ZZ 交換 1H-15N HSQC スペクトルは、300 ms の混合時間を使用して Sb4 上に記録されました (25 °C、100 mM KPi、pH 7.0)71,72。タンパク質構造は、PROCHECK-NMR73、MOLMOL74、および PyMol (Schrodinger)55 を利用して表示および分析されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された NMR 構造は PDB に登録されています: [https://doi.org/10.2210/pdb7MN1/pdb]。 [https://doi.org/10.2210/pdb7MQ4/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MN2/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MP7/pdb]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000083]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000084]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000085]。 NMR 割り当ては BMRB に寄託されています: [https://doi.org/10.13018/BMR30901]。 [https://doi.org/10.13018/BMR30902]; [https://doi.org/10.13018/BMR30904]; [https://doi.org/10.13018/BMR30905]; [https://doi.org/10.13018/BMR50907]; [https://doi.org/10.13018/BMR50909]; [https://doi.org/10.13018/BMR50910]; [https://doi.org/10.13018/BMR51719]。このペーパーで参照されている構造は、PDB [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb] で公開されています。 [https://doi.org/10.2210/pdb2VDB/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb1FCC/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb6UAO/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb2LHC/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb1RIS/pdb]。ソースデータはこのペーパーに付属しています。設計モデルはソースデータ内のファイルとして提供されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、国立衛生研究所の助成金 GM62154 (PB および JO へ) および 5R44GM126676 (PB へ) によって支援されました。 NMR 施設は、メリーランド大学、国立標準技術研究所、および WM Keck Foundation からの助成金によって支援されています。博士たちにも感謝します。 Nese Sari と Louisa Wu、原稿を批判的に読み、多くの思慮深いコメントを寄せてくれました。市販製品についての言及は、NIST による推奨または承認を意味するものではありません。

これらの著者は同様に貢献しました: Biao Ruan、Yanan He、Yingwei Chen。

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[ PubMed ] [ 相互参照 ] Yanan He、Yihong Chen、Tsega Solomon、Thomas Kauffman、D. Travis Gallagher、John Orban & Philip N. Bryan

メリーランド大学生物工学部、カレッジパーク、メリーランド州、20742、米国

ダナ・モタバル

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D.トラヴィス・ギャラガー

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タンパク質設計: Yw.C.、BR、EC、JO、PB。熱力学および結合解析を実施: BR、Yw.C.、DM、RS、PB。動的光散乱実験を実施: TG; NMR実験/構造解析を実施：YH、Yh.C.、TS、TK、JO。論文執筆: JO (NMR および構造解析)、Yw.C.、BR、PB (残りのセクション)。

ジョン・オーバンまたはフィリップ・N・ブライアンとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Ruan, B.、He, Y.、Chen, Y. 他タンパク質フォールドスイッチングネットワークの設計と特性評価。 Nat Commun 14、431 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36065-3

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受信日: 2022 年 7 月 14 日

受理日: 2023 年 1 月 13 日

公開日: 2023 年 1 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36065-3

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ネイチャーコミュニケーションズ (2023)

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